新型双歧杆菌属细菌的制作方法技术

本发明专利技术提供一种即使在环境因素不同的条件下存活性也优异的双歧杆菌属细菌的制作方法、根据本制作方法得到的新型双歧杆菌属细菌和该细菌的检测方法。在作为环境因素不同的条件的系统中交替传代培养保存，制作在交替传代培养保存中使用的全部条件下的存活性优异的双歧杆菌属细菌。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及、根据本制作方法得到的新型双歧杆菌属细菌和该细菌的检测方法。
技术介绍
双歧杆菌属细菌是人体肠内细菌菌落中的主要细菌，已知具有便秘、腹泻的改善性等的整肠作用、血清胆固醇上升抑制作用、免疫活化作用等对人体健康有益的作用。因此，以各种发酵饮食品、活菌制剂等的形态有多种市售品出售，特别是发酵乳饮食品，具有优异的嗜好性，因此，适于双歧杆菌属细菌的持续摄取。双歧杆菌属细菌是专性厌氧菌，对氧、低pH、高酸度敏感，发酵饮食品中制造时的增殖、保存时的存活性等操作困难的点很多。为了得到双歧杆菌属细菌的生理效果，认为必 须要使尽可能多的菌活着到达肠道，特别是提高饮食品中的菌的存活性、即饮食后的到达肠道的到达率是非常重要的因素。为了解决这样的问题，通过改良制造方法、添加各种存活性改善剂，例如，N-乙酰葡糖胺、泛酸、肽类、乳果糖等，进行发酵饮食品水平的存活性改善。但是，这样的双歧杆菌属细菌的存活性改善剂的添加，会导致制造成本增加，引起嗜好性的降低等问题，因此不容易使用。此外，还研究了将刚制造后的含有双歧杆菌属细菌的发酵物填充以在不透氧性的包装构成的容器中，完全切断与氧的接触的方法。但是，不透氧性容器并不完美，缺乏成型的自由度，并且使用复合材料，废弃物处理很复杂，容器本身价格也高，其利用有很多制约。因此，改善发酵饮食品等中的双歧杆菌属细菌的存活性的根本解决方法，是制作即使在好氧的条件、低pH、高酸度的条件下也具有高的存活性的双歧杆菌属细菌，作为这样的菌株的例子，可以列举短双歧杆菌ΠΤ 10001 (FERM BP-8205)(专利文献I)、短双歧杆菌 SBR3212 (FERM P-11915)(专利文献 2)、两歧双歧杆菌 Τ 4002 (FERM BP-1038)(专利文献3)等。但是，这些存活性改善株存在只能够期待在其制作方法中所使用的环境下的存活性改善效果的问题。即，双歧杆菌属细菌变异株的制作中，通常使用在双歧杆菌属细菌繁殖困难的环境下进行传代培养保存、从而获得生存株的方法，能够期待在这些菌株的制作阶段中所使用的环境下一定的存活性改善效果，但是在除此以外的环境下，无法期待存活性改善效果。因此，以现有方法所得到的双歧杆菌属细菌，不能适用于在与变异株制作条件不同的条件下流通的饮食品中，具有极低的通用性。此外，虽然原因仍不清楚，但是已知在环境因素恶化的条件(例如，酸性区域pH)下进行传代培养保存而得到的存活性改善菌株，在更稳定条件的中性区域PH下适用该菌株，也不能发挥存活性改善效果，这也是无法得到在各种饮食品中能够适用的通用性高的菌株的一个原因。现有技术文献专利文献专利文献I :W003/040350号国际公开小册子专利文献2 :日本专利第2922013号专利文献3 :日本特公昭61-19220
技术实现思路
专利技术所要解决的问题因此，本专利技术的课题在于提供即使在环境因素不同的各种条件下存活性也优异的双歧杆菌属细菌的制作方法、根据本制作方法得到的新型双歧杆菌属细菌和该细菌的检测方法。用于解决专利技术的方法 本专利技术的专利技术人为了解决上述课题，进行了深入的研究，结果发现，通过在作为环境因素不同的条件的至少2种系统中交替进行2次以上的传代培养保存，能够得到在交替传代培养保存中所使用的全部条件下的存活性优异的双歧杆菌属细菌。并且，对于所得到的新型双歧杆菌属细菌的特异的检测方法进行了研究，结果发现，能够对该细菌DNA片段进行特异性扩增的引物，使用该引物，能够特异地检测、定量该细菌。并且，发现组合这些引物和膜透过性色素，能够定量该细菌的活菌数目。S卩，本专利技术提供一种双歧杆菌属细菌的制作方法，其特征在于，在作为环境因素不同的条件的至少2种系统中交替进行2次以上的传代培养保存。此外，本专利技术提供由上述制作方法得到的双歧杆菌属细菌。此外，本专利技术提供饮食品，特别是发酵乳饮食品，其特征在于，含有上述双歧杆菌属细菌。此外，本专利技术提供具有序列号I或序列号2所示的碱基序列或与该序列互补的碱基序列的DNA片段。此外，本专利技术提供具有序列号I或序列号2所示的碱基序列或与该序列互补的碱基序列的短双歧杆菌ΠΤ 12272 (FERM BP-11320)用引物。此外，本专利技术提供短双歧杆菌 Τ 12272的检测方法，其特征在于，使用上述引物。此外，本专利技术提供短双歧杆菌 Τ 12272的菌数的定量方法，其特征在于，使用上述引物。此外，本专利技术提供短双歧杆菌 Τ 12272 (FERM BP-11320)的活菌数定量方法，其特征在于，对以膜透过性色素处理过的被检测体，使用上述引物进行PCR反应。专利技术的效果通过本专利技术的双歧杆菌属细菌的制作方法，能够得到在产品或流通条件等的环境因素不同的条件下存活性也优异的双歧杆菌属细菌。该菌株能够适用于各种饮食品，并且，饮食品中的菌的存活性高，因此，能够有效地发挥双歧杆菌属细菌所具有的生理效果。此夕卜，通过本专利技术的制作方法对具有抗幽门螺杆菌作用等的特异生理效果的双歧杆菌属细菌进行改良，由此，能够制作能够在各种饮食品中利用的菌株，因此，本专利技术的工业上的利用性极高。使用本专利技术的DNA片段，能够特异地检测、定量饮食品中、粪便中或肠内的上述存活性优异的短双歧杆菌YIT 12272。附图说明图I是表示短双歧杆菌 Τ 12272特异的RAPD带的碱基序列。以四边包围YIT12272特异的引物的碱基。图2是表示由利用膜透过性色素处理进行定量的PCR得到的 Τ12272的定量值的变化。 图3是表不PMA处理的最适条件。图4是表示由PMA处理得到的粪便中加热处理后的 Τ 12272的定量值的变化。图5是表示粪便中所添加的活的YIT 12272的菌数和定量的PCR (PMA处理)得到 的 Τ 12272的定量值的关系。具体实施例方式在本专利技术中，作为环境因素，是指对双歧杆菌属细菌的增殖或存活性有影响的全部因素，可以列举培养液或饮食品中的pH、渗透压、酸度、培养·保存温度、培养·保存时间、溶解氧量、光、压力、水分活性、共存微生物、营养因子(糖类、蛋白质、肽、乳脂肪成分等脂肪类、维生素类、矿物质类、脱脂乳固体成分、酵母提取物等的双歧杆菌属细菌的增殖因子等)、抗生素、培养方法(静置培养、搅拌培养、振动培养、通气培养等)、灭菌方法、调合方法、填充方法、保存容器的材质等，特别优选使用对双歧杆菌属细菌的增殖和存活性有影响的重要的环境因素的pH、渗透压、酸度、培养温度、营养因子等。这里，光包括可见光、非可见光的任一种，酸度是指中和9g的试样所需要的1/10规定氢氧化钠水溶液的量(mL)。此外，“作为环境因素不同的条件的至少2种系统”是指使某种特定环境因素的质和/或量发生变化的至少2种系统，例如，使培养液或饮食品的pH、渗透压、酸度、培养温度、营养因子等发生变化的至少2种类以上的系统，更具体来说，可以列举例如使培养液或饮食品的pH从5变化到3,例如使渗透压从600m0sm (毫渗透摩尔)变化到950m0sm,例如使酸度从6变化到20，例如使培养液的培养温度从37°C变化到30°C，例如使培养液或饮食品中的糖类从消化性糖变化为难消化性糖，例如通过搅使的溶解氧浓度提高等方法来改变的系统。对作为标的的环境因素、其质和/或量的变化没有特别限定，优选考虑要适用以本专利技术的方法制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：左古知行，三浦美加，岛川康久，宫崎幸司，藤本淳治，渡边幸一，
申请(专利权)人：株式会社益力多本社，
类型：发明
国别省市：