纯化肽的制备性RP-HPLC方法技术

描述了在RP-HPLC系统上将目标多肽与至少一种不想要的成分分离的方法，其中至少一个洗脱步骤在或接近目标肽的pI值下进行。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在RP-HPLC系统上将目标多肽与至少一种不想要的成分分离的方法，其中至少一个洗脱步骤在或接近目标肽的pi值下进行。
技术介绍
对于蛋白质和肽(多肽)的纯化(即与杂质分离)和分析，色谱是一种熟知且广泛使用的方法。可以应用多个不同的色谱原理，反相高效液相色谱(RP-HPLC)就是其中之一。RP-HPLC的分离原理基于多肽溶液和色谱树脂表面上的疏水性配体之间的疏水缔合。RP-HPLC纯化通常由一个或多个下面的部分组成平衡、加载、洗涤、洗脱和再生。 传统的RP-HPLC是在液相的pH低于或高于待纯化目标分子的pi下进行的，一些杂质很难被分离。由于存在无法控制产品(即目标肽)沉降的风险，在Pl下进行洗脱一般不是优选的操作模式。ScienceDirect，Talanta 75 (2008),第76-82页披露了用于分离肽的pH梯度。在此通过重复从2. 5到10. 5的相同的pH梯度，应用了重复pH梯度。已经描述了多种制备性反相色谱法。US2009036652涉及使用制备性反相色谱法纯化蛋白质，W02007071767涉及使用制备性反相色谱法纯化维生素K依赖性多肽，US20060211616涉及纯化胰高血糖素样肽。然而，需要优化的RP-HPLC纯化方法，其中获得好的纯化效果而无需使用包括重复PH梯度的粗放方法 专利技术概述 本专利技术涉及在RP-HPLC系统上将液体混合物中的目标的多肽与至少一种不想要的成分分离的方法，所述方法包括 a.在RP-HPLC系统中引入含有目标多肽的混合物，该混合物溶解于流动相，其中该流动相的PH值与目标多肽的pi值相差至少I个单位； b.将流动相的pH调节至与目标多肽的pi值相差小于I个单位的pH值，其中调节pH通过分段过程或采用PH梯度进行； c.洗脱目标多肽从而获得其纯化的组合物(composition)。本专利技术的一个方面，在步骤b和步骤c之间又增加了一个步骤，其中，pH被再次调节至与待纯化肽或蛋白质的Pl值相差至少I个单位的PH值，其中所述的调节通过分段过程或采用PH梯度进行。本专利技术的一个方面，所述方法包括与步骤b同时应用有机修饰剂梯度，以在RP-HPLC系统上保留目标肽的同时去除不想要的杂质。附图说明图I.制备性分离的AU28tl对时间的色谱图，洗脱在pH 4. 5下进行； 图2.分离的AU28tl对时间的色谱图，洗脱在pH 5. 2下进行； 图3.分离的AU28tl对时间的色谱图，洗脱在pH 5. 5下进行；图4.在不同的pH4. 5,5. 2和5. 5下进行实验的重叠的色谱 图5.分离的AU28tl对时间的色谱图。洗脱如下进行首先在pH (从中性至pi或接近PD和EtOH梯度(刚好在目标肽峰出现之前)的组合下进行，然后用从4. 5到中性的pH梯度洗脱。图6.分离的AU■对时间的DesB30人胰岛素色谱图。洗脱如下进行首先在pH(从4.0提高至pi或接近pi)和EtOH梯度(刚好在目标肽峰出现之前)的组合下进行，接下来在Pl或接近Pl的PH下、然后在从5. 8到8. 0的pH梯度下分段洗脱。图7.分离的 AU28tl 对时间的 Arg34, Lys26(NE-( Y-Glu(Na-十六酰)))-GLP-l(7-37)肽的色谱图。洗脱如下进行首先在pH(从pH8.0降低至pi或接近PD和EtOH梯度(刚好在目标肽峰出现之前)的组合下进行，接下来在Pl或接近Pl的pH下、然后在从5. I到4. 0的pH梯度下分段洗脱。专利技术描述 本专利技术涉及用于纯化多肽的制备性反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，其中至少一个洗脱步骤在或接近目标肽的Pl值下进行。更特别地，本专利技术涉及用于纯化含有目标多肽的混合物的制备性RP-HPLC，所述方法包括以下步骤 a.在RP-HPLC系统中引入含有目标多肽的混合物，该混合物溶解于流动相，其中该流动相的PH值与目标多肽的pi值相差至少I个单位； b.将RP-HPLC系统的pH调节至与目标多肽的pi值相差小于I个单位的pH值，其中调节PH通过分段过程或采用pH梯度进行； c.洗脱目标多肽从而获得其纯化的组合物。本专利技术的一个方面,在步骤b中使用pH梯度来调节pH。专利技术人发现当采用本专利技术的方法时，获得了从目标肽中分离杂质的出乎意料地好的分离效果。特别是已经可能分离那些由传统的RP-HPLC方法难以去除的杂质，例如相关杂质。另外，通过应用本专利技术的纯化方法，避免了需要达到从至少一种不想要的成分中进行目标多肽的所需分离的复杂纯化方法。本文使用的术语“色谱”是指用于混合物和组分的化学分离的任何方法，其依赖于混合物的组分对固定相的选择性吸引。实例包括吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱。本文使用的术语“RP-HPLC”是指反相高效液相色谱或反相高压液相色谱。HPLC用于基于化合物的极性以及与色谱柱固定相的相互作用来分离化合物。反相色谱是应用在液相色谱中的洗脱过程，在该过程中流动相比固定相显著地具有更高的极性。本文使用的术语“弓丨入液体混合物”是指在流动相液体中弓I入含有目标多肽和至少一种不想要的成分的混合物。本文使用的术语“pi”是指等电点，是特定的分子(例如多肽)不带净电荷时的pH。在其pi下的蛋白质不具有净电荷，因而水溶性此时最低。因此，增高蛋白质浓度时存在着沉淀的风险。在比Pl高或低一个PH单位的情况下，静电荷显著增加(取决于涉及的氨基酸，净电荷增加至最大净电荷的90%)，溶解性可设想达到约10倍，因此蛋白质不大倾向于沉淀。一般认为在与肽或蛋白质的Pl值相差约I. 5-2个单位的pH值下可最好地避免沉淀，其中特定的蛋白质结构域以及其它的特点可能影响这些值。本文使用的与目标的多肽的pi值相关的术语“单位”是指用作测定pH的标准的确定的量值。举例来说，若目标的多肽的Pl值为4. 5，与该多肽的pi值相差一个单位则为3. 5或5. 5，与该多肽的pi值相差I. 5个单位则为3. 0或6. O。本文使用的与色谱(例如RP-HPLC)相关的术语“制备性”是指经色谱纯化足量的物质(例如多肽)以便以纯化的形式进一步应用。因此制备性色谱法与分析性色谱法相对，分析性色谱法仅用于分析目的。在本专利技术的一个方面，所述方法中应用pH和有机修饰剂梯度的组合作为第一步，于所述肽的Pl值或接近该Pl值开始的PH梯度用作第二步。按照这样的方面，应用了如下 的方法其中第一步包括与有机修饰剂梯度相结合的PH梯度，其中所述pH梯度开始于与目标多肽的Pl值相差至少I个单位的PH值、并且变至与所述目标多肽的pi值相等或接近的PH，直到一种或多种杂质(其比目标多肽洗脱得要快)由RP-HPLC系统洗脱下来，而目标多肽则保留在该系统上；第二步进一步应用PH梯度，其中所述pH梯度从与所述目标多肽的Pl值相等或接近的PH变为与所述目标多肽的pi值相差至少I个单位的pH。专利技术人发现了通过pH和有机修饰剂调节的这种组合达到了特别理想的纯化。本专利技术的一个方面，在pH等于或接近目标多肽的pi值的步骤后，在附加的步骤中将流动相的PH调节到高于目标多肽的pi值至少I个单位。专利技术人发现该附加步骤甚至进一步将不想要的产品沉降最小化。本文使用的术语“流动相”是指弓I入色谱柱本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：X吴，A博格斯内斯，
申请(专利权)人：诺沃—诺迪斯克有限公司，
类型：发明
国别省市：