本发明专利技术涉及一种实时荧光定量检测猪鼻支原体的引物和探针，特别是用于猪鼻支原体的实时荧光定量PCR检测，属于生物技术领域。确定以猪鼻支原体P37基因保守区序列作为扩增靶序列，设计合成一对特异性引物和一条分子信标探针应用于猪鼻支原体的定量检测。根据不同浓度梯度的阳性质粒制作的定量标准曲线可以看出，不同梯度定量模板数的对数值与Ct值之间有较好的相关关系，其相关系数为0.999；同时，该检测方法具有很高的灵敏度，最低能检测到10个拷贝的病原体。对其他病原进行检测表明，该方法具有很好的特异性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种实时荧光定量检测猪鼻支原体的引物和探针，特别是用于猪鼻支原体的实时荧光定量PCR检测，属于生物
技术介绍
猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)是一种能够引起猪多发性衆膜炎、关节炎、耳炎、肺炎等病症的致病性支原体。猪鼻支原体不仅在猪群中普遍存在，同时也是人类和多种动物细胞培养中常见的污染物。作为一种常见病原菌，猪鼻支原体通常由母猪或大猪传染给小猪。已有研究者证实了能从10%母猪和30% 40%断奶仔猪的鼻腔分泌物中分离出该支原体。一旦感染，该支原体在上呼吸道迅速传播并且能从感染猪的肺脏和鼻咽管中分离到。在英国和美国的慢性猪肺炎案例中，50%以上都能检测到猪鼻支原体的存在；同时在地方性肺炎暴发群中几乎每次都能够分离到猪鼻支原体。从捷克斯洛伐克、丹麦、德国和英 国分离出的几株猪鼻支原体通过呼吸道途径能诱发猪肺炎。猪鼻支原体的三株捷克斯洛伐克分离物和一株英国分离物，可诱导无菌小猪发生肺炎。国内宁夏农学院曾以两株疑似猪鼻支原体(宁农3和宁农5)培养物滴鼻接种小猪，诱发轻度肺炎。台湾林俊宏用猪鼻支原体分离株ATIT-1、3、7混合物气管内注射可以诱发部分攻毒猪发生典型的猪支原体肺炎病变，并成功从大部分攻毒猪肺中分离到猪鼻支原体。另外，研究表明，猪鼻支原体与人类的肿瘤发生有关。迄今为止，对猪鼻支原体的检测方法有培养法、血清学检测方法等，而对猪鼻支原体检测主要以分离培养为主,所需要的时间较长,亟需建立一种敏感性高的、快速的、等量的分子生物学检测方法。本专利技术提供了猪鼻支原体实时荧光定量PCR的引物和探针，有助于快速、定量诊断猪鼻支原体的感染。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是为了克服现有的以分离培养为主对猪鼻支原体检测的时间长、无法准确定量的缺陷，提供一种能快速、灵敏、准确、定量检测猪鼻支原体的实时荧光定量PCR检测方法。技术方案—种快速检测猪鼻支原体的荧光定量PCR引物和探针，引物1:P37-F 5' -AGAAGGTTCTTTTGCTTGAACACA-3'引物2:P37-R 5' -TGCTTCCATCTTTTCATTTGCTT-3'分子信标探针5，-FAM-ATCAGCAACAAAACCTT-MGB-3，检测过程中PCR扩增反应体系为无菌双蒸水8μ12Χ反应预混液(.含Taq廳、dNTP及缓冲液)P20μΜ 引物 IΙμ 20μΜ 引物 2Ιμ 20μΜ分f信标探针Ιμ 校正染料Rox0.5 μ 标准阳性模板ρΜ-Ρ37或样品模板DNAΙμ 反应条件为95 V预处理IOmin,进行40个循环反应，每个循环反应包括 950C 15s，53。。lmin，于 53°C 时测定荧光值。用所述的引物对和分子信标探针可以制备猪鼻支原体的荧光定量PCR检测试剂盒。有益效果本专利技术与现有技术相比具有以下优点和效果I、定量准确；2、检测速度快，仅I小时，加上DNA提取的制备，共仅需3_4h ；3、步骤简单；4、可同时进行高通量的样品检测。在本专利技术提供检测猪鼻支原体荧光定量PCR的引物和探针，将其用于猪鼻支原体定量检测，建立了检测猪鼻支原体荧光定量PCR的方法，该方法的灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，完全可以满足快速鉴定诊断猪鼻支原体的要求。 附图说明图I不同拷贝数阳性质粒荧光PCR扩增的动力学曲线。分别以模板数为I. OXlO8-L OXlO1拷贝/ml及水为阴性对照进行Taqman PCR分析。图2显示猪鼻支原体荧光定量PCR的标准曲线。针对模板数为I. OX IO8-L OX IO1拷贝/ml的反应体系进行Taqman PCR分析。当猪鼻支原体个数为I. O X IO1时，检测样品的Ct值为34左右，即检测下限灵敏度可达I. OX IO1拷贝/ml。绘制得到的标准曲线的斜 率为-3. 121，在Y轴截距为38. 243，相关系数R2=O. 999。具体实施例方式试剂包括a) DNA裂解液，b) Taq DNA聚合酶，c)标准阳性模板，d)荧光定量反应液，其特征是荧光定量反应液中含有引物和荧光探针，引物为正向引物(SEQ ID N01)5，-AGAAGGTTCTTTTGCTTGAACACA-3’，和反向引物(SEQ ID NO: 2)，5’ -TGCTTCCATCTTTTCATTTGCTT-3’，荧光探针(SEQ ID NO. 3)序列为 5，-ATCAGCAACAAAACCTT-3，，荧光探针 5，端标记FAM (荧光报告基因)，3’端标记MGB基因(荧光淬灭基团)，标准阳性模板pM_P37 (SEQ IDNO:4)是含有猪鼻支原体P37蛋白基因的1212个核苷酸片段构成的pMD18_T(购于Takara公司)可在大肠杆菌Trans5 α (购于Takara公司)中增殖。贮存浓度为IX 101°拷贝/ μ 1，使用前系列稀释。实验所用的标准品为含有目的扩增片段的质粒ΡΜ-Ρ37，该质粒转化大肠杆菌Trans5 α增殖后用碱裂解法提取，用分光光度计测A26tl(所测样品在吸收波长为260nm紫外线照射下的光密度)的定量并稀释至I X IOltl拷贝/ μ 1，-20°C保存。在制作标准曲线时，所使用的标准阳性模板pM_P37 DNA(SEQ ID NO:4)为5’ -ttgctcaaaaaatttaaaaattttattctattttcatctatattttcgccaatagcatttgctatatcatgttctaatacaggagtagtcaagcaagaggatgtatcagttagtcaaggtcaatgagataaaagtataacatttggtgtttcagaagcttggttaaacaagaaaaaaggaggtaaagaagttaacaaagaagttattaatacatttttagaaaatttcaaaaaagaatttaataaactcaaaaatgcaaatgataaaaccaaaaacttcgatgacgttgattttaaagtaactccaattcaagactttactgtgttgttaaacaatttatctactgacaatcctgaattagattttggaattaatgcttcaggaaaattggtagaatttctaaaaaataatcctggtataataactccagcattagaaacaacaactaattcttttgtatttgacaaagaaaaagataaaatttatgttgatggtacagattcagatccacttgtaaaaattgctaaagaaattaataaaatttttgttgaaactccatatgcaagttgaactgatgaaaatcataagtgaaatggtaatgtttatcaaagtgtttacgatccaactgttcaagctaatttttatagaggaatgatttgaataaaaggtaatgatgaaactctagctaaaattaaaaaagcttgaaatgataaagattgaaatacatttagaaattttggaattttacacggtaaagataattcttcttctaaattcaagttagaagaaactatattaaaaaaccactttcaaaat本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪鼻支原体荧光定量PCR检测引物对和分子信标探针，其特征是，引物1：P37？F？？5′？AGAAGGTTCTTTTGCTTGAACACA？3′引物2：P37？R？？5′？TGCTTCCATCTTTTCATTTGCTT？3′分子信标探针：5’？FAM？ATCAGCAACAAAACCTT？MGB？3’
【技术特征摘要】
1.一种猪鼻支原体荧光定量PCR检测引物对和分子信标探针，其特征是， 引物 I :P37-F 5' -AGAAGGTTCTTTTGCTTGAACACA-3' 引物 2:P37-R 5' -TGCTTCCATCTTTTCATTTGCTT-3' 分子信标探针5’ -FAM-ATCAGCAACAAAACCTT-MGB-3，2.根据权利要求I所述的一种猪鼻支原体荧光定量PCR检测定量PCR检测引物对和分子信标探针，其特征在于，检测过程中PCR扩增反应...
【专利技术属性】
技术研发人员：白方方，邵国青，武昱孜，刘茂军，冯志新，熊祺琰，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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