本发明专利技术公开了一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因aroAS001及其应用，该基因的碱基序列如SEQ?ID?NO.3所示；该基因可用于提高农作物的草甘膦抗性，具体的是将基因aroAS001、含有基因aroAS001的表达载体或克隆载体，或含有上述的表达载体或克隆载体的菌株转化入农作物中。本发明专利技术的基因是一种优良的草甘膦抗性基因，转入该基因的aroA基因缺陷型菌株能在含400mM以下草甘膦的培养基中生长，与目前已报道的其它物种EPSP合成酶基因相比，表现出优良的草甘膦抗性，取得了意料不到的有益效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因aroA及其应用，该基因是从高抗草甘膦的肺炎克雷伯氏菌菌株中克隆得到的，对草甘膦表现出增强的抗性。
技术介绍
草甘膦(Glyphosate)因理化性质稳定并具有高效、广谱、低毒、低残留、易分解和不破坏土壤环境等优点，自1971年孟山都公司成功开发以来，备受市场青睐，现已成为全球销量最大的植物保护产品。由此，草甘膦也成为抗除草剂转基因作物研究的首选对象，抗草甘膦转基因作物是目前全球播种面积最大的转基因作物。草甘膦作用靶标酶EPSP合成酶(EPSPS)基因的克隆、表达及其功能验证等也因此成为现代分子生物育种研究的重点。 在自然界中，植物和微生物都含有编码EPSP合成酶(EPSPS)的基因。植物中编码该合酶的基因为epsps,而在微生物中编码该合酶的基因为aroA。1983年孟山都公司和华盛顿大学的科学家分离得到了根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) CP4,该株系的EPSPS对草甘膦不敏感，具有很高的抗性。1986年孟山都公司将CP4EPSPS基因导入到大豆基因组中，成功培育出抗草甘膦大豆新品种。此后科学家们分别从细菌包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、可变盐单胞菌、假单胞菌、金黄色酿脓葡萄球菌、结合分支杆菌中克隆得到编码EPSP合成酶的aroA基因，从拟南芥、烟草、牛筋草、小蓬草等植物中克隆得到了 epsps基因(He etal. , 2001 ；Borgesetal. , 2007 ；Melanie etal.,2005;Brotherton etal. , 2007;Dinelli etal.,2006;Zhaoetal. , 2011; Baerson etal.，2002;刘柱等，2004)。其中牛筋草、胡萝卜及烟草epsps基因可耐受 IOOuM 以下的草甘勝(Baerson etal. , 2002 ；Shyr etal. , 1992;Dyer etal. , 1988)，水稻epsps基因突变体可耐受IOOmM以下的草甘膦(Zhou etal.，2006);可变盐假单胞菌的EPSP合酶基因可耐受50mM以下的草甘膦(刘光全等，2004);人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)中的EPSP合酶基因可耐受300mM以下的草甘膦(金芜军等,2010)。目前关于杂草对草甘膦抗性机制有多方面的说法。Lorraine-Colwill等认为瑞士黑麦草抗性生物型和敏感生物型EPSPS酶的活性以及印sps基因序列都没有差异，主要是由植物体内的吸收输导差异而产生了对草甘膦的抗性。而Gaines等认为，EPSPS酶的表达量增加也可以使植物对草甘膦产生抗性。而草甘膦靶标酶EPSP合成酶基因epsps的核酸序列位点发生突变，致使生物体对草甘膦产生抗性，有很多研究报道。
技术实现思路
为了克服现有转基因作物草甘膦抗性偏低的缺陷，本专利技术的首要目的在于提供一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因ar0AS(l(ll。本专利技术的另一目的在于提供上述基因UroAstltll)在提高农作物草甘膦抗性中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因aroA■，其碱基序列如SEQID NO. 3 所示。上述基因(aroA.)是利用同源克隆的方法从一株高抗草甘膦的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapeneumoniae)kpSOOl菌株中克隆得到的,该菌株已于2012年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 6189。上述基因(aroAS(m)可用于提高农作物的草甘膦抗性，包括将aroA_、含有aroAS001的表达载体或克隆载体、含有上述表达载体或克隆载体的菌株转化入农作物中。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果肺炎克雷伯氏菌ar0AS(l(ll基因是一种优良的草甘膦抗性基因，转入该基因的aroA 基因缺陷型菌株能在含400mM以下草甘膦的培养基中生长，与目前已报道的其它物种EPSP合成酶基因相比，表现出优良的草甘膦抗性，取得了意料不到的有益效果。附图说明图I为实施例2中aroAS(m基因PCR扩增产物电泳图；其中M_DL2000Marker，l-aroAS001 基因 PCR 扩增产物(1284bp)。图2为实施例3中重组质粒pProA-aroAS(l(ll的菌落PCR检测结果图；其中，M-DL2000Marker, 1-9-第1_9号克隆的扩增结果。图3为实施例4中，kpSOOIEPSPS蛋白的诱导表达SDS-PAGE检测结果图；M_低分子量标准蛋白，I-含空载体PProA菌株DH5 a IPTG诱导表达6小时，2-含pProA-aroAS(l(ll重组质粒菌株DH5 a IPTG诱导表达6小时。图4为实施例5中，分别转入pProA和pPr0A-ar0AS(l(ll质粒的ER2799菌株分别在含OmM和50mM草甘膦培养基中的生长曲线图；其中,aroAS001-0是转入ProA-aroAS(l(ll质粒的ER2799菌株在不含草甘膦的培养基中的生长曲线图，aroAS(l(ll-50是转入Pr0A-ar0AS(l(ll质粒的ER2799菌株在含50mM草甘膦的培养基中的生长曲线图，pProA-0是转入pProA质粒的ER2799菌株在不含草甘膦的培养基中的生长曲线图，pProA-50是转入pProA质粒的ER2799菌株在含50mM草甘膦的培养基中的生长曲线图。图5为实施例5中，分别转入pProA和pProA-aroAS(l(ll质粒的ER2799菌株在不同浓度草甘膦浓度的培养基中的生长曲线图；其中，aroAS(l(ll是转入pProA-aroAS(l(ll质粒的ER2799菌株在不同浓度草甘膦浓度的培养基中的生长曲线图，pProA是转入pProA质粒的ER2799菌株在不同浓度草甘膦浓度的培养基中的生长曲线图。具体实施例方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例I高抗草甘膦菌株的筛选分离，是从广东蔬菜田间取土样，以草甘膦为筛选标记，分离获得肺炎克雷伯氏菌kpSOOl菌株；具体包括以下步骤I、高抗草甘膦的肺炎克雷伯氏菌的分离(I)取广东蔬菜田间土样10g，加入到90mL 150mmol/L草甘膦(原粉)的基础盐培养基(液体)中，置于37°C、120r/min培养72h。(2)取步骤(I)IOmL培养液加入到含200mmol/L草甘膦(原粉)的基础盐培养基(液体)培养，370C、120r/min培养72h ;依此类推，将前一轮培养液逐级加入300、350、400mmol/L草甘膦(原粉)的基础盐培养基(液体)培养，370C、120r/min培养72h。(3)取适量培养液分别在含350mmol/L草甘膦的营养琼脂、马丁、高氏一号平板培养基上，划线分离。(4)挑取步骤(3)中的单菌落接种于含400mmol/L草甘膦(原粉)的基础盐培养基(液体)培养，37 0C、120r/min 培养 72h。(5)取适量培养液在含400mmol/L草甘膦的营养琼脂马本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码5？烯醇式丙酮酰莽草酸？3？磷酸合酶的基因aroAS001，其碱基序列如SEQ？ID？NO.3所示。
【技术特征摘要】
1.一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因BroAscitll，其碱基序列如SEQID NO. 3 所示。2.权利要求I所述的基因aroAS(l(ll在提高农作物草甘膦抗性中的应用。3.根据权利要求2所述的基因ar0AS(l(ll在提高农作物草甘膦抗性中的应用，其特征在于将基因aroAS(l(ll转化入...
【专利技术属性】
技术研发人员：田兴山，张纯，冯莉，吴丹丹，张妤，杨彩宏，岳茂峰，崔烨，
申请(专利权)人：广东省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：
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