可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，包括序列1～序列4中所示的DNA片段，还包括该核酸序列的一系列衍生物。本发明专利技术核酸适体的筛选方法包括以下步骤：首先合成随机单链DNA文库和引物，然后Cell-SELEX获得人肝癌细胞株Bel-7404特异核酸适体，PCR扩增文库，制备DNA单链文库，然后经过重复筛选、阴性筛选、多轮筛选等步骤后，得到可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体。本发明专利技术的核酸适体可在识别人肝癌细胞株Bel-7404或者制备检测人肝癌细胞株Bel-7404的试剂盒中应用，具有特异性强、无免疫原性、分子量小、稳定、易于保存和标记等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种核酸适配体及其筛选和应用，尤其涉及一种可用于检测人肝癌细胞的核酸适体及其筛选方法和应用。
技术介绍
核酸适体(aptamer)是通过指数富集配基的系统进化技术(SELEX)筛选得到的，能特异结合IE物质的单链寡聚核苷酸(ssDNA或ssRNA)。核酸适体与抗体功能类似,但是与抗体相比具有更多的优势，具有更高的亲和力与特异性；无免疫原性；能够化学合成，成本低；可进行标记；稳定性好，易于保存等优点。核酸适体的靶分子更为广泛，包括金属离子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白质，并从单一靶标扩展至完整的病毒颗粒及细胞等复合物靶标。因此，核酸适体具有广泛的应用前景。肝癌是发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌，原发性肝癌是临 床上最常见的恶性肿瘤之一。全世界每年新发肝癌患者约60万，居恶性肿瘤的第五位。对于恶性肿瘤而言，如果能及早发现、尽早治疗，则癌症的病情往往容易得到控制，降低肝癌发病引起的死亡风险。因此，开发一种更加灵敏、简便、高效和具有特异性的肝癌检测手段，对于肝癌的临床治疗将具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性、无免疫原性、能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记的可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体及其衍生物，还提供前述核酸适体的筛选方法和应用。为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列包括以下序列I 序列4中的任意一条序列所示的DNA片段 序列I :5，-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTATAAACGGTCACCCGAGTAGAGGGTATGGACTTCGACGTATGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’ ； 序列2 5，-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAATGGAATGTGGGAGGGGGACTCAGGACAGTCACGGGACATGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’ ； 序列3 5，-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAGAGGACCCCAGGGTATGGACTTCGACGTCTGAGGTCATCTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’ ； 序列4 5 ’ -ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAAAGTTCAACAAGTGGGAGGGGGACTTAGGACAGTCATCTTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’。上述的可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列上的某一位置可优选被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。上述的可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列上优选结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记。以上不论是经部分取代或者经过修饰后的核苷酸序列，都具有原核酸适体基本相同的性质和功能，即都可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列包括以下三种序列中的任意一种 (1)与上述所列核酸适体的核苷酸序列的同源性在60%以上； (2)与上述所列核酸适体的核苷酸序列进行杂交的序列；或者 (3)上述所列核酸适体的核苷酸序列转录的RNA序列。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体衍生物，所述衍生物是上述所列核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架。以上不论是衍生出的核酸适体还是衍生出的其他衍生物，都具有原核酸适体基本相同的性质和功能，即都可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供一种上述的核酸适体的筛选方法，包括以下步骤 (1)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物随机文库 RS40 :5’ -ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA(40N) TGTAGGAGGGTGCGGAAGTA5’ 引物5’ -FAM-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA-3’3’ 引物5’ -Biotin-TACTTCCGCACCCTCCTACA-3’ ； (2)Cell-SELEX获得人肝癌细胞株Bel-7404特异核酸适体培养Bel-7404细胞至基本铺满瓶底，去除培养基后用缓冲液洗涤，然后与随机序列在冰上孵育后，弃溶液；再将上述随机文库溶解、恒温振荡后与经前述处理后的Bel-7404细胞在冰上孵育；孵育完成后弃掉孵育瓶内的液体，并用缓冲液冲洗孵育瓶，然后用无菌水刮取孵育瓶内的Bel-7404细胞并置于沸水浴中加热，加热完成后再离心取上清，即为筛选所得的Bel-7404特异核酸适体文库； (3)PCR扩增文库将步骤(2)中筛选所得的Bel-7404特异核酸适体文库进行常规PCR扩增，得到扩增产物； (4)制备DNA单链文库将链霉亲和素修饰的琼脂糖微球离心去上清，再将步骤(3)中PCR扩增所得的双链DNA与琼脂糖微球在常温下孵育，通过双链DNA上的生物素与琼脂糖微球上的链霉亲和素的亲和作用将双链DNA充分捕获到琼脂糖微球表面，洗涤后加入碱液至琼脂糖微球中，常温下反应、离心、收集上清；将上清液过除盐柱后收集滴下的溶液，此即为DNA单链文库； (5)重复筛选将步骤(4)得到的DNA单链文库重复上述步骤(2) (4)的过程一次； (6)阴性筛选以人胆管癌QBC-939为对照，将步骤(5)后筛选得到的DNA单链文库进行阴性筛选，阴性筛选的具体操作为培养人胆管癌QBC-939细胞至基本铺满瓶底，去除培基后用缓冲液洗涤，然后与无关序列在冰上孵育后，弃溶液；再将筛选得到的DNA单链文库溶解、恒温振荡后与经前述处理后的人胆管癌QBC-939细胞在冰上孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的溶液； (7)多轮筛选将步骤(6)所收集的溶液继续进行上述步骤(2) (4)的操作过程，然后再依次重复步骤(6)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)的过程；重复筛选过程中用流式细胞术监测文库对Bel-7404细胞识别能力的增强情况，直至文库对Bel-7404细胞的识别能力满足要求后，将所得产物经克隆测序分析，最终得到可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体。上述的核酸适体的筛选方法，所述PCR扩增时的工艺条件优选为94°C 3min,94°C 30sec,63°C 30sec, 72°C 30sec,经合适循环轮数(本领域人员经过不同循环轮数的产物进行琼脂糖电泳和凝胶成像，选择电泳条带清楚且没有非特异性扩增的产物的循环轮数，即为合适的循环轮数)，72°C 3min。上述的核酸适体的筛选方法，所述步骤(2)中，与无关序列在冰上孵育的时间优选控制在15 min 30min，与所述Bel-7404细胞在冰上孵育的时间优选控制在30 min 60min,所述沸水浴中的加热时间优选控制在10 min 15min ;所述步骤(4)中，与琼脂糖微球在常温下孵育的时间优选控制在30 min 45min，加入碱液后的反应时间优选控制在15min 20mino作为一个总的技术构思，本专利技术还提供一种上述的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可用于检测人肝癌细胞株Bel？7404的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列包括以下序列1～序列4中的任意一条序列所示的DNA片段：序列1：5’？ATGAGAGCGTCGGTGTGGTATAAACGGTCACCCGAGTAGAGGGTATGGACTTCGACGTATGTAGGAGGGTGCGGAAGTA？3’；序列2：5’？ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAATGGAATGTGGGAGGGGGACTCAGGACAGTCACGGGACATGTAGGAGGGTGCGGAAGTA？3’；序列3：5’？ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAGAGGACCCCAGGGTATGGACTTCGACGTCTGAGGTCATCTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA？3’；序列4：5’？ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAAAGTTCAACAAGTGGGAGGGGGACTTAGGACAGTCATCTTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA？3’。

【技术特征摘要】
1.一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列包括以下序列I 序列4中的任意一条序列所示的DNA片段 序列I :5，-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTATAAACGGTCACCCGAGTAGAGGGTATGGACTTCGACGTATGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’ ； 序列2 5，-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAATGGAATGTGGGAGGGGGACTCAGGACAGTCACGGGACATGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’ ； 序列3 5，-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAGAGGACCCCAGGGTATGGACTTCGACGTCTGAGGTCATCTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’ ； 序列4 5，-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAAAGTTCAACAAGTGGGAGGGGGACTTAGGACAGTCATCTTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’。2.根据权利要求I所述的可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，其特征在于所述核酸适体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。3.根据权利要求I或2所述的可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，其特征在于所述核酸适体的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶 T 己 O4.一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，其特征在于所述核酸适体的核苷酸序列包括以下三种序列中的任意一种 (O与权利要求I或2或3中所述核酸适体的核苷酸序列的同源性在60%以上； (2)与权利要求I或2或3中所述核酸适体的核苷酸序列进行杂交的序列；或者 (3)权利要求I或2或3中所述核酸适体的核苷酸序列转录的RNA序列。5.一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体衍生物，其特征在于所述衍生物是权利要求I或2或3中所述核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架。6.一种如权利要求I所述的核酸适体的筛选方法，包括以下步骤 (1)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物 随机文库 RS40 :5’ -ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA(40N) TGTAGGAGGGTGCGGAAGTA 5’ 引物5’ -FAM-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA-3’3’ 引物5’ -Biotin-TACTTCCGCACCCTCCTACA-3’ ； (2)Cell-SELEX获得人肝癌细胞株Bel-7404特异核酸适体培养Bel-7404细胞至基本铺满瓶底，去除培养基后用缓冲液洗涤，然后与随机序列在冰上孵育...

【专利技术属性】
技术研发人员：王柯敏，郭秋平，刘小丹，羊小海，谭誉宇，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：