本发明专利技术公开一种高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子，所述适配子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本发明专利技术所述高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子，能够很好的同高尔基体膜蛋白GP73结合，具有较高的特异性和灵敏度，而且保存时间长，成本较低。本发明专利技术还公开了所述适配子的制备方法及其在制备诊断或治疗肝细胞癌药物中的用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种适配子、其制备方法及其用途，尤其是一种高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子、其制备方法及其在制备诊断或治疗肝细胞癌药物中的用途。
技术介绍
随着基因工程技术的发展，人们可以方便地根据基因序列进行各种蛋白的人工表达，大大推动了基于抗原抗体反应的免疫检测技术的快速发展。尽管如此，由于抗体本身的 不稳定性，如制备周期长、杂交瘤细胞在长期冻存和传代过程中易发生染色体突变，以及对外界环境敏感，受pH、温度影响易失活，保存期短等特性的影响，一定程度上制约了免疫检测技术的特异性和灵敏度。肝细胞癌(HCC)是世界五大常见癌症之一，其增长速度非常之快。肝硬化是HCC发病过程中的一个重要发展过程，因此，肝硬化患者组成了 HCC的高危人群。近年来研究发现，一种高尔基体膜蛋白GP73以良好的敏感性被视为最具有潜力的HCC标记物。GP73作为潜在的HCC标记物，首先要考虑的是建立一种经济、简便的抗干扰能力强的方法来检测GP73，这样才能真正将GP73的价值推广运用于临床。目前，检测人GP73的酶联免疫吸附实验(ELLSA)试剂盒已经出现，但由于受到抗体来源和自身不稳定性质的影响，如抗体本身的不稳定性(制备周期长，杂交瘤细胞在长期冻存和传代过程中易发生染色体突变)，及对外界环境敏感，受pH、温度影响易失活，保存期短等特性的影响，一定程度上制约了免疫检测技术的特异性和灵敏度，同时动物实验难以控制，制备抗体实验周期较长，成本较高，故目前仅限于科研使用，难以推向临床。适配体是一种DNA或RNA的寡核苷酸单链,它能与其他分子祀标高亲和力、高特异性地结合。它是利用指数富集配体进化系统(systematic evolution of ligands byexponential enrichment, SELEX)技术从人工合成的寡核苷酸文库中筛选而来的。这一技术是基于文库中的寡核苷酸单链能折叠成三维空间立体结构，与靶标高亲和力、高特异性地结合的特性建立起来的。适配子(Aptamer，又称核酸适体)，它是通过模拟自然进化过程的指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)筛选得到的具有识别功能的新型核酸分子，其本质为RNA或单链NDA(single stranded DNA,ssDNA)片段，这些片段在遇到靶标分子时，可形成口袋、发卡、G-四聚体等各自独特的三维结构与靶分子结合，类似于抗体特异性识别相应抗原表位的过程。与抗体相比，适配子与靶标的亲和力更高，甚至强于其天然配体，解离常数(kd)多在pmol/L-nmol/L之间；适配子能够分别出靶分子结构上细微的差别，甚至可以区分I个甲基或I个羟基的差别，形成了识别的高度特异性，而且适配子筛选周期更短，一般一个SELEX需要8 15个循环，约2个月时间。更为重要的是适配子便于修饰，可以在合成时精确、定点、随意连接其他功能基团和分子，如巯基、氨基和荧光素、生物素、酶等。由于适配子为单核苷酸序列，一旦筛选出，就可以快速源源不断的人工合成相同的适配子，几乎不存在适配子制备的批间误差，真正实现高效、快速、低成本的合成，摒弃了传统的复杂、重复、难控的抗体制备的动物实验。因此，适配子的问世是生物诊断领域又一次革命性的新突破。迄今筛选到的凝血酶、茶碱、抗血管内皮因子等适配子已在诊断中彰显出广阔的应用前景。基于适配子技术，发展高特异性和高灵敏度的检测新方法也称为当前生命科学领域一个非常活跃的研究探索方向，但是针对高尔基体膜蛋白GP73适配子的筛选及其用于肝癌早期诊断的研究在国内外尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种特异性和灵敏度较高、成本较低的高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子；同时，本专利技术还提供了所述适配子的制备方法及其用途。 为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为一种高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子，其核苷酸序列为5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAGTTGGTTTTTTTTTGTTATTTAGAGTAAAAACCTTGTGTGTAGTGACTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ 。所述高尔基涂膜蛋白GP73核酸适配子中，两端分别为序列固定的20个碱基，中间45个碱基是与GP73某个空间位点结合的关键结构。本专利技术所述高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子的序列能够很好的同GP73结合，并运用于临床实验。目前监测GP73方法的原理主要基于抗原抗体反应，但抗体的制备需要动物实验，抗体自身保存使用的条件较为苛刻，具有很多不稳定因素，本专利技术所述的高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子刚好弥补了这些不稳定因素，而且制备方法和成本较抗体低的多，可为后期临床的广泛使用打下坚实的基础。本专利技术还提一种如上所述高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子的制备方法，所述方法包括以下步骤(I)随机ssDNA文库的构建构建人工合成的随机SsDNA文库，文库中所有寡核苷酸分子的两端为固定相同序列，中间为随机序列，随机序列的长度为20-1 IOnt，文库中不同寡核苷酸分子的容量为IO14-IO15 ；(2)将步骤(I)构建的ssDNA文库直接用于筛选，筛选过程包括靶标的固定、文库与靶标共同孵育、洗涤并弃去未结合的适配子、洗脱并收集结合靶标的适配子、PCR扩增收集的适配子、PCR得到双链DNA转变成ssDNA进行下轮筛选；或者将步骤(I)构建的ssDNA文库反转录成RNA文库，然后用于筛选，筛选过程包括靶标的固定、文库与靶标共同孵育、洗涤并弃去未结合的适配子、洗脱并收集结合靶标的适配子、将收集到的适配子反转录成ssDNA、PCR扩增收集的适配子、PCR得到双链DNA转变成ssDNA进行下轮筛选；(3)重复步骤(2)进行8-15轮，即可筛选到高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子。适配子的SELEX筛选过程中，首先要构建人工合成的随机ssDNA文库，文库中所有寡核苷酸分子的两端为固定相同序列，中间为随机序列，随机序列的长短一般在20-110nt，所以文库中不同寡核苷酸分子的容量可达到IO14-IO15,构成了具有丰富分子构象的多样性文库，理论上包括了几乎能与自然界所有分子相结合的适配子。ssDNA文库可直接用于筛选，也可反转录成RNA文库后用于筛选，两者的区别在于ssDNA较RNA更为稳定，但RNA文库的构象较ssDNA更为丰富，实验中可根据具体的实验要求选择不同的文库。SESEX整个过程以ssDNA文库为例，包括靶标的固定、文库与靶标共同孵育、洗涤并弃去未结合的适配子、洗脱并收集结合靶标的适配子、PCR扩增收集的适配子(若选择RNA文库，先要将收集到的适配子反转录成ssDNA，再进行PCR扩增)、PCR得到的双链DNA转变成ssDNA (该ssDNA为初始文库中的单链，不是其反链)进行下轮筛选。重复上述步骤进行8-15轮，即可筛选到与靶标高亲和力和特异性的适配子。此时，将最后一轮筛选所得的PCR产物进行克隆测序，分析适配子的序列，并进行特异性和亲和力的鉴定，进一步分离出有价值的适配子。作为本专利技术所述高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子的制备方法的优选实施方式，所述步骤(I)中构建的ssD本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子，其特征在于，其核苷酸序列为：5“？ACGCTCGGATGCCACTACAGTTGGTTTTTTTTTGTTATTTAGAGTAAAAACCTTGTGTGTAGTGACTCATGGACGTGCTGGTGAC？3“。
【技术特征摘要】
1.一种高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子，其特征在于，其核苷酸序列为5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAGTTGGTTTTTTTTTGTTATTTAGAGTAAAAACCTTGTGTGTAGTGACTCATGGACGTGCTGGTGAC-3，。2.一种如权利要求I所述高尔基体膜蛋白GP73核酸适配子的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤 (1)随机ssDNA文库的构建构建人工合成的随机ssDNA文库，文库中所有寡核苷酸分子的两端为固定相同序列，中间为随机序列，随机序列的长度为20-1 IOnt，文库中不同寡核苷酸分子的容量为IO14-IO15 ； (2)将步骤(I)构建的ssDNA文库直接用于筛选，筛选过程包括靶标的固定、文库与靶标共同孵育、洗涤并弃去未结合的适配子、洗脱并收集结合靶标的适配子、PCR扩增收集的适配子、PCR得到双链DNA转变成ssDNA进行下轮筛选；...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐霞，蔡媛媛，
申请(专利权)人：徐霞，
类型：发明
国别省市：
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