测定多肽的序列变体的方法技术

本发明专利技术涉及测定生产的多肽中氨基酸序列突变的方法，所述方法包括下述步骤：a)提供生产的多肽的样品，b)用蛋白酶孵育样品中的多肽，c)使用与高分辨质谱法(FT-ICR/FT-轨道阱)和MS/MS偶联的逆相色谱实施肽的氨基酸序列片段的二维分析，d)通过搜索在给定的保留时间的信号强度的差异和通过评价关于氨基酸序列突变的差分信号，通过一起比较对样品获得的LC-MS数据集和参考样品的数据集进行数据评价。用于数据评价(d)的参考样品能够是良好表征的标准物或是待分析的样品中的一份。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本文报道了，所述方法包括胰蛋白酶消化多肽，片段的色谱分离，经分离的片段的高分辨质谱分析以及测定序列变体。
技术介绍
蛋白质在当今的医药组合中起重要的作用。对于人类应用，每种治疗性蛋白质必须符合不同的标准。为了保证生物药剂对人的安全性，治疗性蛋白质的特征必须在某些限制之内，并且特别地必须移除在生产过程中积累的副产物。与想要的形式不同的、多肽的氨基酸组分和序列的任何改变和修饰被分别定义为序列变体。这能够是导致氨基酸序列改变的核酸突变、不想要的翻译后修饰(PTM)或异常的多肽变体(缩短的或伸长的形式)的。为了保证多肽的一致性并且避免错误，必须评估生物学机制(例如复制的保真 性，转录和翻译的准确性)和技术方法(细胞系发展中的转染和扩增以及发酵条件)对序列变体的存在的影响。也必须提供这样的方法，所述方法为发现和鉴定潜在的序列变体提供高敏感性。例如，细胞系发展方法能够导致序列变体，所述序列变体可分别成为对细胞系转换和克隆变化关键的。在意外缺少饲养基质中的某些基质成分下的发酵和下游加工(DSP)可分别导致序列变体或氨基酸的翻译后修饰。因此，必须检查序列变体的存在以验证产品的同质性和一致性。Barnes, C. A. S.,等，Mass. Spectrom. Rev. 26 (2007) 370-388 报道了质谱法用于重组蛋白药物的结构性表征的应用。由Zhang, Z.,等，在Mass. Spectrom.Rev. 28(2009) 147-176中报道了质谱法用于治疗性抗体的结构性表征。Yu，X. C.等(Anal.Chem. 81 (2009)9282-9290)报道了通过高分辨质谱法鉴定重组单克隆抗体中密码子特异性的丝氨酸到天冬酰胺的错翻译。Houde, D.,等，J. Chromatogr. 1123 (2006) 189-198报道了通过质谱法测定蛋白质氧化以及转移到质量控制的方法。专利技术概述本文提供了用于测定氨基酸序列变体(即多肽的氨基酸序列中的突变)的方法。也能够随其间接地测定核酸序列变体。更详细地本文报道了测定(生产的)多肽中的氨基酸序列突变的方法，所述方法包括下述步骤a)提供(生产的)多肽的样品，b)用蛋白酶孵育样品中的多肽，c)使用与肽的氨基酸序列片段的高分辨质谱法(FT-ICR/FT-轨道阱)和MS/MS分析偶联的逆相色谱实施二维分析，d)通过搜索在给定的保留时间的信号强度的差异并且通过评价关于氨基酸序列突变的差分信号，通过一起比较样品获得的LC-MS数据集与参考样品的数据集进行数据评价。用于数据评价(步骤d)的参考样品能够是良好表征的标准或者是待分析的样品中的一份。本文报道的第一个方面是测定氨基酸序列变体、特别地多肽的氨基酸序列中的氨基酸突变的方法，所述方法特征在于包括下述步骤a)提供多肽的至少两份样品，b)用蛋白酶孵育样品，c)通过包括逆相色谱分离和质谱法分析和/或MS/MS分析的组合的二维数据分析，分析经孵育的样品，d)将在步骤c)中用一份样品获得的数据集定义为参考样品，并将在步骤c)中用其他样品获得的数据集与参考样品的数据集比较，由此测定的每个差异是多肽的氨基酸序列变异(突变)并从而测定多肽的氨基酸序列变体。本文报道的另一个方面是测定多肽的氨基酸序列中的氨基酸序列突变的方法，所述方法特征在于包括下述步骤a)提供多肽的至少两份样品，b)用蛋白酶孵育样品，c)通过包括逆相色谱分离和质谱法分析和/或MS/MS分析的组合的二维数据分析，分析经孵育的样品，d)将在步骤c)中用一份样品获得的数据集定义为参考样品，并将在步骤c)中用其他样品获得的数据集与参考样品的数据集比较，由此测定的每个差异是多肽的氨基酸序列突变并从而测定多肽的氨基酸序列突变，或下述步骤a)提供多肽的至少一份样品，b)用蛋白酶孵育样品，c)通过包括逆相色谱分离和质谱法分析和/或MS/MS分析的组合的二维数据分析，分析经孵育的样品，d)将在步骤c)中用样品获得的数据集与用如步骤b)和c)中报道的方法测定的参考样品的数据集比较，由此测定的每个差异是多肽的氨基酸序列突变并从而测定多肽的氨基酸序列突变。提供的样品可源自通过编码多肽的核酸的瞬时转染获得的不同的克隆，或源自稳定转染的细胞系，或源自不同龄、或不同的发酵规模、或在不同条件下进行的发酵的细胞系。在一种实施方案中提供从2至10000份样品，在另一种实施方案中提供从2至1000份样品，还在另一实施方案中提供从2至348份样品。在一种实施方案中方法还包括步骤e)通过MS/MS碎裂和数据分析测定氨基酸序列变化(突变)的身份和位置。在另一实施方案中，提供额外的样品，所述额外的样品包含用具有已知的氨基酸序列变异(突变)的多肽掺料(spike)的多肽。除了提供的样品，孵育、分析并比较额外的样品。在一种实施方案中，分析在少于8. 0的pH值下和在少于40°C的温度下实施。这些条件降低了方法诱导的氨基酸序列改变。在其他实施方案中PH值为从pH 6. 5到少于pH8.0。在另一实施方案中，温度为从20°C至40°C。在另一种实施方案中，在三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中提供样品，用于酶促消化。还在另一实施方案中，用蛋白酶孵育样品是通过蛋白酶将多肽切割为长度从3至60个氨基酸残基的片段。在一种实施方案中，步骤d)中的比较是用一种、或一些、或全部MS-电荷状态的数据实施的。在其他实施方案中，比较包括将参考样品和每份其他样品的质谱法总离子色谱图(MS-TIC)覆盖，由此计算全部覆盖的和对准的质量的强度比率，并且必须认为具有多于、10的比率的峰是氨基酸序列变异(氨基酸序列突变)。还在其他实施方案中，比较还包括将DNA翻译的蛋白水解的片段肽模式与样品的质谱法总离子色谱图(MS-TIC)比较。对于氨基酸序列变体(氨基酸序列突变)搜索被研究的多肽的编码核酸序列中的单碱基替换、缺失和插入是允许的，在计算机芯片上(in silico)翻译并用与方法中使用的相同的酶在计算机芯片上消化获得的序列。随后，通过匹配肽的实验测定的MS/MS片段波谱与衍生自前文描述的计算机方法的肽的理论MS/MS波谱鉴定氨基酸序列变体(氨基酸序列突变)。 在其他实施方案中，多肽是完整的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白缀合物。在另一实施方案中，样品中的多肽是还原的并且在用蛋白酶孵育之前，自由的巯基残基被羧甲基化。在根据本文报道的方法的步骤中，全部分别地处理样品，即单独地并不作为混合物处理。在一种实施方案中在还原步骤、孵育步骤，和分析步骤中单独处理样品。在一种实施方案中方法是用于高通量测定的方法。在一种实施方案中，用蛋白酶孵育样品16小时至18小时并随后立即添加甲酸或三氟乙酸。在其他实施方案中，用蛋白酶孵育样品4小时并随后立即添加甲酸或三氟乙酸。·本文报道的另一个方面是生产多肽的方法，所述方法包括选择生产多肽的细胞，其中多肽分别包含全部经处理的样品中的最小数目和最小比率的氨基酸序列变异(即氨基酸序列中的突变)。本文报道的另一个方面是生产多肽的方法，所述方法包括选择生产多肽的细胞，其中多肽不包含可检测的氨基酸序列突变(变异)。在一种实施方案中，最小数目和最小比率的氨基酸序列变异(氨基酸序列中的突变)分别是关于参考样品或预先测定的氨基酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·科尔，J·T·雷古拉，F·维格朔夫，A·策克，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：