一种金标银染定量检测汞离子的方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种金标银染定量检测汞离子的方法及其试剂盒，特点是包括将载玻片加热清洗干燥，浸入APTES溶液中，于室温下硅烷化处理再用乙醇洗净后，于110-130℃真空干燥1-3h后得到硅烷化载玻片的步骤；将DNA和纳米金溶液混合，振荡摇匀，室温下温育加水稀释得到特异性DNA-纳米金探针溶液的步骤；将特异性DNA-纳米金探针溶液与样品溶液混合后，滴在硅烷化载玻片上室温至试样点完全干燥后，滴银染试剂暗箱静置后，立即用蒸馏水冲洗再干燥的步骤；最后进行金标银染信号的定量分析，计算得到待测样品溶液中汞离子的准确浓度的步骤。优点是具有高灵敏度、高选择性且可定量分析汞离子浓度，不仅操作简单而且可现场检测。?

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种汞离子的检测方法，尤其是涉及一种金标银染定量检测汞离子的方法及其试剂盒。
技术介绍
汞(Hg)，是常温下唯一的液态金属，是重金属之一。近年来，人类对重金属汞的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，大量的汞进入大气、水、土壤中存留、积累和迁移。汞的毒性大，在生物体内和环境中残留时间长，严重威胁人类健康，故美国、欧盟、加拿大以及我国等许多国家和地区对食品、生活用品、环境中汞含量都做了严格限定，汞污染的检测 与监控已经成为重点关注的问题。自然界中的汞主要以离子形式(Hg2+)存在，故实现对汞离子的准确、灵敏、快速的现场检测非常重要。目前检测汞离子的方法主要有紫外一可见分光光度法、冷原子吸收光谱法、荧光光谱法、电化学法、离子色谱法、毛细管电泳法、重金属快速测定仪法、试纸条法等。紫外一可见分光光度法选择性差，检出限高；原子吸收光谱法、荧光光谱法、电化学法、离子色谱法、毛细管电泳法，准确度和灵敏度高，但均需使用特定的仪器，价格昂贵，操作繁琐，且要求检测人员具备一定的专业知识，分析成本高，无法应用于现场检测，难以普及；重金属快速测定仪法可应用于现场检测，但灵敏度不高、选择性差，样品预处理复杂；试纸条法以其快速、简便、灵敏而在现场检测中别具优势，但其只能够定性判断是否含有检测限含量以上的Hg2+，无法定量分析得到Hg2+的准确浓度。金标银染(Gold label silver stain)技术是采用一个“夹心式”的基因杂交系统，通过探针DNA识别靶DNA或者其他研究对象，并将纳米金颗粒与DNA杂交系统结合在一起后，浸入含银离子的银染试剂中，由于纳米金颗粒对银离子的还原有催化作用，银染试剂中的银离子在纳米金颗粒表面被还原为单质银而沉积，呈现出黑色的银染信号。纳米金颗粒数目越多，银染信号的灰度值越大，而纳米金颗粒数目取决于体系中靶DNA或者其他研究对象的数目，因此根据银染信号的灰度值即可定量检测靶DNA或者其他研究对象的浓度。目前，国内外还没有关于将金标银染技术应用于定量检测汞离子的相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种高灵敏度、高选择性且可定量分析汞离子浓度的金标银染定量检测汞离子的方法及其试剂盒。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为一种金标银染定量检测汞离子的方法，具体包括以下步骤 (I)娃烧化载玻片的制备 将载玻片置于piranha洗液中，于90-100°C加热20-40 min后取出，用蒸馏水洗涤三次，置于N2氛中干燥后，浸入l-3wt%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液中，于室温下硅烷化处理2-6h，再用乙醇洗净后，于110-130°C真空干燥l_3h后，得到硅烷化载玻片，所述的piranha洗液为98%的浓硫酸和30%双氧水按体积比7 3的比例混合得到； (2)特异性DNA-纳米金探针溶液的制备将 30-40ul 的 100 uM 序列为 HS-5’-TTTTTTTTTT-3’的 DNA 和 O. 5-1. 5 mL 浓度为 20-25nM的纳米金溶液混合，振荡摇匀，室温下温育12-20小时后，加蒸馏水稀释50-100倍，即得特异性DNA-纳米金探针溶液； (3)探针与样品反应及银染放大 将步骤(2)所得的特异性DNA-纳米金探针溶液与样品溶液按体积比1-3 :2-6混合，振荡摇勻10-20 min后,取2-4 uL滴在娃烧化载玻片上,于室温下至试样点完全干燥后,在试样点上滴银染试剂4-6 uL，室温下暗箱静置10-20 min后，立即用蒸馏水冲去多余银染试齐U，然后干燥载玻片； (4)金标银染信号的定量分析 将干燥后载玻片上的金标银染试样点扫描成图片获得待测样品溶液的金标银染信号及其灰度平均值，根据金标银染信号灰度平均值与汞离子溶液浓度之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中汞离子的准确浓度。步骤(2)中所述的纳米金颗粒的直径为15-30 nm，所述的特异性DNA-纳米金探针的结构为 AuNPs-HS-5’ -TTTTTTTTTT-3’。步骤(3)中所述的银染试剂由组分A和组分B组成，所述的组分A为含O. 25 g/mL的AgNO3溶液,组分B为O. 0425 g/mL的氢醌、O. 064 g/mL的朽1檬酸、O. 059 g/mL的朽1檬酸三钠按等体积比混合而成，临用前将组分A、组分B按体积比3 : 100混合即得银染试剂。步骤(4)的具体过程如下 A.用扫描仪将载玻片上的金标银染试样点扫描成图片； B.利用Matlab软件的imread命令，读出每个像素点的灰度值，令信号的灰度值=255一读出的灰度值，使信号的灰度值仍介于O至255之间,无色最小为O,全黑色最大为255,颜色越深，信号的灰度值越大； C.设置信号的灰度值阈值为10，取信号的灰度值>10时的有效像素点，求出有效像素点数目； D.将所有的有效像素点的金标银染信号的灰度值加和，即得金标银染信号的灰度总值； E.用金标银染信号的灰度总值除以有效像素点数目，即得到金标银染信号的灰度平均值； F.配制一系列不同浓度的汞离子溶液，按照前述步骤获得金标银染信号及其灰度平均值，建立金标银染信号灰度平均值与汞离子溶液浓度之间的定量关系； G.根据上述步骤获得待测样品溶液的金标银染信号及其灰度平均值，根据金标银染信号灰度平均值与汞离子溶液浓度之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中汞离子的准确浓度。一种金标银染定量检测汞离子的试剂盒，包括硅烷化载玻片、特异性DNA-纳米金探针和银染试剂，所述的特异性DNA-纳米金探针在纳米金上结合有特异性DNA，所述的特异性 DNA 的序列如下HS-5’ -TTTTTTTTTT-3’。所述的纳米金颗粒的直径为15-30 nm，所述的特异性DNA-纳米金探针的结构为AuNPs-HS-5’ -TTTTTTTTTT-3’ ； 所述的银染试剂由组分A和组分B组成，所述的组分A为含O. 25 g/mL的AgNO3溶液，组分B为O. 0425 g/mL的氢醌、O. 064 g/mL的朽1檬酸、O. 059 g/mL的朽1檬酸三钠按等体积比混合而成，临用前将组分A、组分B按体积比3 : 100混合即得银染试剂。专利技术原理纳米金颗粒表面结合有含10个T碱基的DNA，Hg2+存在时，不同纳米金颗粒表面结合的DNA通过T一Hg2+—T错配相互绞合,使纳米金颗粒聚集，纳米金颗粒数目减少，其对银离子的还原能力降低，还原出来的银离子量减少，产生的金标银染信号颜色变浅，金标银染信号灰度平均值降低。Hg2+浓度越高，纳米金颗粒聚集程度越高，其对银离子的还原能力越低，还原出来的银离子量越少，产生的金标银染信号颜色越浅，金标银染信号灰度平均值越低。另外，通过控制DNA用量以控制同一纳米金颗粒表面DNA相互之间的距离，可以确保纳米金颗粒表面结合的DNA之间并不会发生T一Hg2+— T错配。与现有技术相比，本专利技术的优点在于(1)高选择性，常见金属离子如Pb2+、Cd2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+ 对检测均无干扰。原因在于特异性DNA-纳米金探针的T-Hg2+-T错配对汞离子具有高特异性的识别能力，其它金属离子的干本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种金标银染定量检测汞离子的方法，其特征在于具体包括以下步骤：（1）硅烷化载玻片的制备将载玻片置于piranha洗液中，90？100℃加热20？40？min后取出，用蒸馏水洗涤三次，置于N2氛中干燥后，浸入1？3wt%？的3？氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液中，于室温下硅烷化处理2？6h，再用乙醇洗净后，于110？130℃真空干燥1？3h后，得到硅烷化载玻片，所述的piranha洗液为98%的浓硫酸和30%双氧水按体积比7：3的比例混合得到；（2）特异性DNA？纳米金探针溶液的制备将30？40ul的100？uM序列为HS？5’？TTTTTTTTTT？3’的DNA和0.5？1.5？mL浓度为20？25？nM的纳米金溶液混合，振荡摇匀，室温下温育12？20小时后，加蒸馏水稀释50？100倍，即得特异性DNA？纳米金探针溶液；（3）探针与样品反应及银染放大将步骤（2）所得的特异性DNA？纳米金探针溶液与样品溶液按体积比1？3：2？6混合，振荡摇匀10？20？min后，取2？4？uL滴在硅烷化载玻片上室温至试样点完全干燥后，在试样点上滴银染试剂4？6？uL，室温下暗箱静置10？20？min后，立即用蒸馏水冲去多余银染试剂，然后干燥载玻片；（4）金标银染信号的定量分析将载玻片上的金标银染信号扫描成图片获得待测样品溶液的金标银染信号及其灰度平均值，根据金标银染信号灰度平均值与汞离子溶液浓度之间的定量关系，计算得到待测样品溶液中汞离子的准确浓度。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王泽波，郭智勇，郝婷婷，马青青，杜书平，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：