本发明专利技术公开的人尿酸氧化酶蛋白，由SEQ?ID?NO.3的氨基酸序列组成。本发明专利技术所得到的人尿酸氧化酶蛋白，回复人尿酸氧化酶基因中的突变密码，将回复突变后的人尿酸氧化酶基因导入工程菌中实现人尿酸氧化酶基因的表达，产生具有酶活性的尿酸氧化酶蛋白。本发明专利技术公开的聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合物及药物组合物，具有氧化分解尿酸的活性，可用于治疗高尿酸血症及由于高尿酸引起的疾病(如痛风)。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程技术制备的具有尿酸分解活性的蛋白酶，更具体地说，本专利技术涉及一种新的尿酸氧化酶蛋白及其制备方法。
技术介绍
尿酸氧化酶(urate oxidase、尿酸酶、uricase, E. C. I. 7. 3. 3)是生物体内嗦吟降解代谢途径中的一种酶，催化尿酸氧化为溶解度更高的尿囊素，尿囊素的溶解度比尿酸高约10倍，是更容易排泄的嘌呤代谢物。许多物种体内均发现有尿酸氧化酶，但在高等哺乳动物灵长类体内和人体缺乏此酶，因此尿酸是嘌呤代谢的终产物。尿酸及其盐类在水中溶解度很低，血液中积累过多会导致高尿酸血症，如果尿酸在软组织、关节、器官等处形成结晶而沉积，会导致疼痛性关节炎(痛风)、毁形性尿酸沉积(结节瘤)和肾衰竭。 现有的人尿酸氧化酶蛋白，由于在进化中编码人尿酸氧化酶氨基酸序列第33位和第187位的氨基酸基因序列发生了突变，产生了终止密码，使人尿酸氧化酶基因无法产生具有功能的尿酸氧化酶蛋白。随着经济的发展和人们生活水平的提高，高尿酸血症和痛风的发病率一直在上升。据美国国立卫生研究院NIH的报道，痛风约占所有关节炎病例的5%，是一种最疼痛的风湿疾病，预计约500万美国人患有痛风，其中50，000 70，000名患者禁忌常规疗法或常规治疗无效。痛风是由结缔组织和关节中的针状尿酸结晶沉淀引起的，这些沉淀导致炎症性关节炎，从而引发关节肿胀、发红、发热、疼痛和僵硬，并对受疾病侵袭的关节造成损伤。另外肿瘤疾病及其治疗过程会引发高尿酸血症。高尿酸血症已经成为人类面临的又一代谢性疾病，寻找有效的治疗方法显得非常迫切。用于高尿酸血症和痛风治疗的药物首先是降尿酸药，适用于难治性痛风石性痛风治疗的药物一类主要是通过抑制黄嘌呤氧化酶而使尿酸生成减少的别嘌醇，另一类促进尿酸排泄的药物，如丙磺舒、苯磺唑酮和苯溴马龙多，但因患者存在大量痛风石或较严重的肾功能不全而不适于使用。不少患者对别嘌醇过敏、无效或不能耐受。近年来又有新型降尿酸药上市，非布索坦(febuxostat):是一种特异性黄嘌呤氧化酶抑制剂。非布索坦能在2周内明显降低尿酸水平，近60%的患者能在3个月内达到治疗目标，即血尿酸水平降到6mg/dl。该药不适合于肝功能损害患者，而对轻中度肾功能不全者安全有效。最常见的不良反应是肝功能异常、腹泻、头痛、恶心、呕吐、腹痛、头晕、关节痛和肌肉骨骼症状。有研究表明，尿酸氧化酶降低体内尿酸水平的幅度和速度远远优于其他药物，因此体内补充尿酸氧化酶是治疗高尿酸血症的最佳策略。目前临床上用的尿酸氧化酶来自黄曲霉菌，因有免疫原性，应用大受限制。某些来自于植物或者微生物的尿酸氧化酶更易溶解于医学上可接受的溶剂中。然而，注射微生物酶会很快引起免疫反应，这种免疫反应可能会导致致命的变态反应、使酶失活或者被迅速从血液循环中清除。来源于哺乳动物(包括猪和狒狒)、昆虫氛基酸序列的酶由于免疫原性和在生理pH条件下不溶性问题，没有成为可用于临床的候选药物。中国专利申请99811738. 2公布了猪和狒狒的尿酸氧化酶序列嵌合的尿酸氧化酶，中国专利申请03109150. 4是一种重组假丝酵母尿酸氧化酶的制备方法,拉布立酶(rasburicase)是基因重组的黄曲霉尿酸氧化酶，仍然具有免疫原性和发生过敏的可能性，不适合长期使用。不少人都考虑用修饰尿酸氧化酶以降低其免疫原性，但经修饰后催化活性大大下降，而且免疫原性却未能全消。美国风湿病学会(ACR) 2005年度会议发布的II期观察研究结果显示，高血尿酸和难治性痛风患者经Savient制药公司的试验药物聚乙二醇一尿酸酶治疗后，血尿酸浓度可持续显著降低，在已公布的II期开放性标记试验的两个病例中，观察聚乙二醇-尿酸酶治疗可溶解痛风石。虽然取得了疗效，但该公司开发的产品pegloticase仍然有产生过敏反应的危险性。因此治疗高尿酸血症及长期用药治疗痛风需要免疫原性更低，安全性更高的尿酸氧化酶以降低过敏反应性和提高治疗的效果。·
技术实现思路
本分明的目的是提供一种人尿酸氧化酶蛋白，这种人尿酸氧化酶蛋白回复人尿酸氧化酶基因中的突变密码，将回复突变后的人尿酸氧化酶基因导入工程菌中实现人尿酸氧化酶基因的表达，产生具有酶活性的尿酸氧化酶蛋白。本专利技术所设计的人尿酸氧化酶蛋白，由SEQ ID NO. 3的氨基酸序列组成。作为优选，本专利技术所设计的人尿酸氧化酶蛋白包含在氨基末端或者羧基末端或者氨基和羧基末端两者截短1-20个氨基酸的SEQ ID NO. 3的氨基酸序列。作为优选，本专利技术所设计的人尿酸氧化酶蛋白包含33位、46位、110位、140位、200位、220位、240位氨基酸置换的SEQ ID NO. 3的氨基酸序列。本专利技术所得到的人尿酸氧化酶蛋白，是人体自身应该进化产生的蛋白质氨基酸序列，最接近人体蛋白质序列，因此对人体的免疫原性是最低的。本专利技术所得到的人尿酸氧化酶蛋白，复人尿酸氧化酶基因中的突变密码，将回复突变后的人尿酸氧化酶基因导入工程菌中实现人尿酸氧化酶基因的表达，产生具有酶活性的尿酸氧化酶蛋白。本专利技术所设计的一种核酸序列，其特征在于编码权利要求I 3的人尿酸氧化酶蛋白的核酸序列。本专利技术所设计的一种核酸序列，其特征在于包含权利要求4所述的核酸序列。作为优选，所述的核酸载体，其特征在于包括pET系列载体、pPEPTIDE、pMAL-C2x、pGEX4T、pGEX5X、pGEX6P、pQE30、pTrcHisB、pTWIN、pBV220、pPICZ a、pPIC9K、PGAPZ a、PYES2/CT、Bacmid DNA,pcDNA3. I、pcDNA4. 0 或 EGFP。本专利技术所设计的一种宿主细胞，其特征在于包含权利要求6所述的核酸载体。本专利技术提供宿主细胞，该宿主细胞具有包含人尿酸氧化酶编码核酸的核酸载体，宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞或者动物细胞。本专利技术的人尿酸氧化酶蛋白可以直接在宿主细胞中表达，也可以通过翻译后加工修饰分泌到宿主细胞外，还可以以融合蛋白形式表达，再通过酶切加工获得人尿酸氧化酶蛋白。本专利技术所设计的一种制备上述人尿酸氧化酶蛋白的方法，其特征在于包括宿主细胞表达所述核酸序列的培养条件下培养权利要求7的宿主细胞步骤，以及分离纯化所表达的人尿酸氧化酶蛋白的步骤。本专利技术所设计的一种聚乙二醇人尿酸氧化酶蛋白结合物，其特征在于它包含权利要求I 3任一项权利要求所述的人尿酸氧化酶蛋白，所述人尿酸氧化酶蛋白与聚乙二醇分子共价连接。作为优选，所述的人尿酸氧化酶蛋白的每个亚基包含2 12个聚乙二醇分子。作为优选，所述的聚乙二醇分子的分子量为5kd IOOkcL作为优选，所述的聚乙二醇分子经活化后与人尿酸氧化酶蛋白上氨基共价连接。 活化聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mPEG-SS)、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)、单甲氧基聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG-2-NHS)、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酸酯(mPEG-SPA)、单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)、Y型聚乙二醇NHS酯、Y型聚乙二醇乙醛、葡萄糖聚乙二醇NHS酯、半乳糖聚乙二醇NHS酯、甲氧基聚乙二醇乙酸酯(mPEG-SCM)、甲氧基聚乙二醇碳酸酯(mPEG-SC)、单甲氧基聚乙二本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人尿酸氧化酶蛋白，其特征在于由SEQ？ID？NO.3的氨基酸序列组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐辉，张明劼，
申请(专利权)人：杭州俊丰生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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