本发明专利技术公开一种果蝇视网膜发育模型体外培养构建方法，包括：果蝇细胞培养液配方和制备，透气性可视培养平台的搭建和制片方法，使用激光共聚焦显微镜进行追踪观测视网膜细胞的发育，重塑，分裂和分化等步骤。本发明专利技术的系统设计合理，操作简便快捷，可以在体外环境中培养果蝇幼虫的视网膜长达3小时，便于实时追踪观察视网膜的早期发育过程，为研究视网膜发育的细胞和分子机制，筛选视网膜发育相关基因及其致病机理，药物筛选的毒理学评价，以及在眼睛疾病模型中筛选相关药物提供了有利工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种果蝇视网膜发育模型的体外培养系统，及其在视网膜发育相关基因和药物筛选中的应用。
技术介绍
果蝇由于其饲养方法简单低廉，繁殖迅速且大量，基因组精简清晰便于研究，遗传手段较多且操作简便等优点，被科学界公认为一种优良的模式生物。自从20世纪初，摩尔根利用果蝇证实了孟德尔定律，提出了遗传学第三定律-“连锁与交换定律”并因此获得1933年诺贝尔医学和生理学奖之后，基于果蝇的研究逐步揭示了胚胎发生和器官发育的分子调控机理。经大批科学家长时间的研究成果证实，果蝇中发现的大多数发育机理，在哺乳动物(包括人类)中有高度的保守性。 果蝇的复眼尽管和人眼在形态上有很大的差别，但它们都是由晶状体，色素层(巩膜)和视网膜这三种基本的成像结构组成。任何一部分结构的发育异常都是致盲的。视网膜发育相关的重要基因和信号通路，大多在果蝇中最先发现。比如著名的fct信号通路，它几乎调控眼睛发育所有步骤(包括胚胎期眼睛区域决定，眼睛形态发生，细胞增殖分化和凋亡，视网膜神经形成和生长等等)，就是最先在果蝇中发现的。随后在果蝇中的相关研究帮助科学家们理解了哺乳动物中的fct通路，而果蝇中的这些成果也因此获得了 1995年诺贝尔医学和生理学奖。随后的大量研究表明，这些重要基因和信号通路在人类中同样影响包括眼睛在内的多种器官发育；而相关基因的异常调控和表达，会造成各种器官发育异常，甚至导致肿瘤生成和转移。如今，果蝇视网膜已经发展为一种理想的人类眼部疾病模型，应用于研究常染色体显性遗传视网膜色素变性(Autosomal Dominant RetinitisPigmentosa)这类遗传性眼部疾病，以及亨廷顿氏舞蹈症(Huntington, s Disease),帕金森病(Parkinson, s disease)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease)等神经退化性疾病引发的视觉功能退化。因此，探索果蝇视网膜早期发育的过程，对于揭示人类眼睛等器官发育的细胞和分子机理，阐释各种眼部疾病的发病机理，以及药物筛选和毒理学评价等领域都有十分重要的意义。目前对果蝇视网膜早期发育过程的理解，还停留在上世纪90年代初期。WolfT，Ready, Cagan等科学家通过对果蝇视网膜固定片的观察，推测了视网膜每隔两小时的发育进程，提出了关于视网膜形态发育(Morphogenesis)方式的一些假说。然而，由于早期视网膜发育过程无法在体内进行观察，也缺少有效的体外培养方法，所以其两小时内的实时发育细节至今还没有能够弄清，关于视网膜形态发育过程的假说也依然只是猜测。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是建立一种能够实时追踪记录果蝇视网膜早期发育模型的体外培养系统，具体技术方案包括以下步骤I.配制用于果蝇视网膜体外培养的器官培养液，器官培养液由体积百分含量的以下组分构成89*%昆虫细胞培养基(Schneider，s Drosophila medium)、10%热灭活胎牛血清(heat-inactivated feral bovine serum)、I青霉素-链霉素混合溶液(penicillin/streptomycin),0. 2mg/ml 膜岛素(insulin)。2.室温条件下，在器官培养液中解剖分离出含有荧光标记(如E-cadherin-GFP)的果蝇三龄后期幼虫视网膜，将其取出并完全浸透于透气底膜(Lumox dish, Sigma)上的新鲜培养液中，加盖四周涂有聚三氟氯乙烯(Halocarbon 700oil)的盖玻片(I8X18mm)，使视网膜稳固封闭于“透气底膜-盖玻片-聚三氟氯乙烯-器官培养液”所构成的厚度约0.3-0. 6mm的液体腔内。3.运用激光共聚焦显微镜实时监测视网膜发育进程。选取物镜为60倍或100倍，激光强度设定为0. 1% -10%，每隔10分钟(或其他大于10分钟且小于3小时的间隔时间)调整焦距至图像清晰，扫描采集并分析视网膜形态发育过程。本专利技术的第二个目的是提供一种快速筛选与视网膜早期发育相关基因的方法，具 体技术方案如下I.将含有某突变基因(a_)的果蝇与含有荧光标记基因(如E-cadherin-GFP)的果蚬交配，整合出如下基因型的果蚬E-cadherin-GFP ;a_。2.分离出基因型为E-cadherin-GFP ;a_的果蝇的视网膜，将其稳固封闭于“透气底膜-盖玻片-聚三氟氯乙烯-器官培养液”构成的液体腔内，以激光共聚焦显微镜检测其视网膜发育进程。3.比较E-cadherin-GFP ;a_果蝇的视网膜和野生型果蝇视网膜发育进程的差异；若有可分辨的发育缺陷产生，则待筛选基因为视网膜发育相关基因。本专利技术的第三个目的是提供一种快速实际的药物毒理学评价方法，具体技术方案如下I.在器官培养液中添加合适浓度的待筛选药物，另以一份加入等量空白溶剂的器官培养液作为对照。2.分离出含有荧光标记(如E-cadherin-GFP)的果蝇视网膜，将其稳固封闭于“透气底膜-盖玻片-聚三氟氯乙烯-含待筛选药物的器官培养液”构成的液体腔内，以激光共聚焦显微镜检测其视网膜发育进程。3.比较药物处理的视网膜和空白对照组视网膜发育进程的差异；若有可分辨的发育缺陷产生，则待筛选药物为视网膜发育毒性药物。本专利技术的有益效果I.本专利技术建立了一种果蝇视网膜早期发育的体外培养系统，能够将观测视网膜发育进程的时间间隔缩短至10分钟，将90年代早期技术的观测精细度提高了 12倍，因而能够实现追踪单个视网膜细胞的运动轨迹，揭示整个视网膜早期形态发育的过程。2.果蝇视网膜是体内器官，与一般的体外培养细胞相比，其发育进展更迅速且切合器官的实际发育状态；与哺乳动物复杂庞大的器官相比，果蝇视网膜仅含两层细胞，不需要切片即可直接用激光共聚焦显微镜观察。所以果蝇视网膜的体外培养兼有细胞培养(利于观测)和器官培养(切合事实)的双重优点，非常适合作为视网膜发育的模型应用。3.在应用于药物毒理学评价和基因筛选时，由于果蝇视网膜体外培养时间小于3小时，而传统的细胞培养筛选方法需要至少I天以上，实验动物筛选方法则需要更长周期，因此本专利技术可以更加快速地对视网膜早期发育相关药物和基因进行初步筛选，并且筛选结果更加贴合实际情况。附图说明图I :用于果蝇视网膜发育模型体外培养的透气性可视平台的组成和构建。图中所示I为Lumox dish的透气底膜；2，器官培养液；3，视网膜样品；4，18X18mm盖玻片；5，聚三氟氯乙烯均匀涂在距盖玻片四周约2-3mm位置。将盖玻片涂有聚三氟氯乙烯的一面向下，稳固封闭住内侧的器官培养液和视网膜样品。图2 :应用体外培养系统实时追踪包含Armadillo-GFP荧光标记的果蝇视网膜发育进程。上排实物图为激光共聚焦显微镜实时扫描，虚线框标志出一个单眼的细胞簇。下排是对上方实物图中细胞边界的手工绘制，其中2，3，4，5，8代表视网膜发育过程中最先产 生的5个视神经细胞，Ml, M2代表非视神经细胞。图3:应用视网膜发育模型的体外培养筛选出与早期发育相关的基因fir。上排实物图为激光共聚焦显微镜实时扫描，虚线框标志出一个单眼的细胞簇。下排是对上方实物图中细胞边界的手工绘制，与野生型果蝇(图2)发育相比，视神经细胞3和4不能本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种果蝇视网膜发育模型体外培养的构建方法，其特征包括以下步骤：(1)配制用于果蝇视网膜体外培养的器官培养液；(2)在上述培养液中分离获得果蝇视网膜，将其置于透气性的可视容器中，室温培养；(3)使用激光共聚焦显微镜追踪记录视网膜细胞的发育过程。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：储丹丹，陈炯，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：
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