改良的使用DXP和MVA途径的异戊二烯生产制造技术

本发明专利技术提供了用于从培养的细胞生产异戊二烯的方法，其中使用DXP途径和MVA途径的不同组分，或与DXP途径和MVA途径有关的组分、铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽和异戊二烯合酶。本发明专利技术也提供了包括这些培养的细胞的组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般地涉及组合物和方法，所述组合物和方法用于改善使用DXP途径和MVA途径从培养的细胞生产异戊二烯。
技术介绍
异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是用于多种合成聚合物、特别是合成橡胶的关键起始材料。多种微生物、植物和动物物种天然地产生异戊二烯。具体地，已经鉴定了异戊二烯的生物合成的两个途径甲羟戊酸(MVA)途径和非-甲羟戊酸(DXP)途径(图19A)。但是，从天然存在的生物体生产异戊二烯的产率在商业上不具有吸引力。每年从异戊二烯的聚合生产约800，000吨的顺式-聚异戊二烯；这些聚异戊二烯中大部分用于轮胎和橡胶工业。异戊二烯也经共聚化而用作其它产品例如鞋类、机械产品、医疗产品、体育用品和胶乳中的弹性体。目前，轮胎和橡胶工业是基于天然和合成橡胶的使用。天然橡胶获自非洲雨林中的橡胶树或植物的乳状汁液。合成橡胶主要是基于丁二烯聚合物。对于这些聚合物，作为乙烯和丙稀生产中的共同产物而获得丁二烯。虽然可以通过分馏石油来获得异戊二烯，但是该物质的纯化是昂贵且耗时的。碳氢化合物的C5流的石油裂解仅产生约15%的异戊二烯。因此，需要更经济的用于生产异戊二烯的方法。特别地，需要以足以满足稳健的商业过程的需要的速率、效价和纯度生产异戊二烯的方法。同样需要用于从廉价的起始材料生产异戊二烯的系统。
技术实现思路
除了别的以外，本专利技术提供了用于生产增加的量的异戊二烯的组合物和方法，其中使用不同的DXP途径基因和多肽以及不同的MVA途径基因和多肽、铁硫簇-相互作用的氧化还原基因和多肽、异戊二烯合酶、和任选的与DXP途径有关的不同基因和多肽、与MVA途径有关的不同基因和多肽以及IDI基因和多肽。在一个方面，本专利技术表征了已经工程化成生产增加的量的异戊二烯的细胞或培养的细胞，其中使用不同的DXP途径基因和多肽、不同的MVA途径基因和多肽、铁硫簇-相互作用的氧化还原基因和多肽、异戊二烯合酶基因和多肽、和任选的DXP途径相关的基因和多肽、MVA途径相关的基因和多肽以及IDI基因和多肽的组合。在一些实施方式中，细胞或培养的细胞包含(i)异源核酸，其编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽，和/或(ii)内源核酸的副本拷贝，该内源核酸编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞或培养的细胞包含(i)异源核酸或内源核酸的一个或多个拷贝，该异源核酸或内源核酸编码铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽，(ii)异源核酸或内源核酸的一个或多个拷贝，该异源核酸或内源核酸编码DXP途径多肽和/或MVA途径多肽，和(iii)异源核酸或内源核酸的一个或多个拷贝，该异源核酸或内源核酸编码异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽可操作地连接至启动子上。在一些实施方式中，DXP途径多肽选自DXS(1-脱氧-D-木酮糖_5_磷酸合酶)、DXR(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶)、MCT (4- 二磷酰基-2C-甲基-D-赤藓醇合酶)、CMK (4- 二磷酰基-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶)、MCS (2C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸合酶)、HDS(1-羟基-2-甲基-2-(E)- 丁烯基4- 二磷酸合酶)和HDR(1-羟基_2_甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶)。在一些实施方式中，DXP途径多肽是DXS、HDS或HDR0在一些实施方式中，细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，该异源核酸或内 源核酸编码IDI (异戊烯基-二磷酸8 -异构酶)多肽。在一些实施方式中，MVA途径多肽选自乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶(AA-辅酶A硫解酶)、3_羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A合酶(HMG-辅酶A合酶)、3_羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A还原酶(HMG-辅酶A还原酶)、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)和异戊烯基磷酸激酶(IPK)。在一些实施方式中，细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，该异源核酸或内源核酸编码IDI (异戊烯基-二磷酸8 -异构酶)多肽。在一个实施方式中，DXP和MVA途径可以在细胞或培养的细胞中以任意比率存在，以从每个途径以任意比例生产异戊二烯。在另一个实施方式中，使用DXP途径生产约10% -50%的异戊二烯，使用MVA途径生产剩余部分。在另一个实施方式中，使用DXP途径生产至少约50%的异戊二烯，使用MVA途径生产剩余部分。在一些实施方式中，本专利技术提供了细胞或培养的细胞，其生产大于约400纳摩尔异戊二烯/克细胞(细胞湿重)/小时(nm0le/gra/hr)的异戊二烯。在一些实施方式中，细胞或培养的细胞将细胞培养基中超过约0. 002%的碳转化成异戊二烯。在一些实施方式中，本专利技术提供了细胞或培养的细胞，其中在发酵运行期间维持HMBPP和DMAPP的水平低于ImM。在其它实施方式中，本专利技术提供了培养的细胞，其中在发酵的指数期内维持HMBPP和DMAPP的水平低于ImM。在其它实施方式中，本专利技术提供了细胞或培养的细胞，其中晚期DXP途径酶、尤其是IspG和IspH维持在与使Dxr的磷酸化水平最小化相一致的水平。在本专利技术的任意方面的一些实施方式中，铁硫簇-相互作用的氧化还原多肽包括黄素氧还蛋白(例如，黄素氧还蛋白I)、黄素氧还蛋白还原酶、铁氧还蛋白(例如，铁氧还蛋白I)、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶以及编码它们的基因或多肽(例如，fpr和fldA)。在一些实施方式中，细胞或培养的细胞包含(i)异源核酸，其编码铁氧还蛋白多肽、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽，和/或(ii)内源核酸的副本拷贝，其编码铁氧还蛋白多肽、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞或培养的细胞包含IspG和fldA。在另一个实施方式中，细胞或培养的细胞包含IspG、fldA和IspH。在一些实施方式中，铁氧还蛋白多肽、铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽可操作地连接至启动子上。在一些实施方式中，细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，该异源核酸或内源核酸编码IDI多肽。 在一些实施方式中，培养的细胞包含(i)异源核酸，其编码黄素氧还蛋白多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽，和/或(ii)内源核酸的副本拷贝，其编码黄素氧还蛋白多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，黄素氧还蛋白多肽、DXP途径多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽可操作地连接至启动子上。在一些实施方式中，细胞另外包含异源核酸或内源核酸的副本拷贝，该异源核酸或内源核酸编码IDI多肽。在一些实施方式中，细胞培养于包括碳源的培养基中，碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油月旨、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生的碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：Z·Q·贝克，J·C·麦考利夫，M·C·米勒，R·E·穆尔，A·T·尼尔森，C·M·派瑞斯，D·H·韦尔斯，W·韦勒，G·K·肖塔尼，D·V·瓦维林，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，固特异轮胎和橡胶公司，
类型：发明
国别省市：