本发明专利技术公开了一种人类K-ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括PCR混合反应液、肽核酸探针、taqman-MGB探针、用于K-ras基因突变检测的内控正反向引物和探针、用于K-ras基因突变检测的外控正反向引物和探针，以及阳性对照品。本发明专利技术将PNA技术与taqman-MGB探针技术相结合，并设计相关的ARMS引物，PNA能够和野生型K-ras基因12或13密码子序列稳定结合，只有突变样本能够被扩增，可以对K-ras基因突变进行检测。本发明专利技术方法快速、简便、特异性好、灵敏度高，可用于临床上K-ras基因突变的筛查。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于临床分子诊断
，具体涉及一种基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，尤其涉及一种人类K-ras基因的7种常见突变的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
K-ras基因定位于人类的第12号染色体上，含有4个编码外显子和I个5'端非编码外显子，共同编码含189个氨基酸组成的ras蛋白，因其分子量为21D，又称为P21蛋白。K-ras基因最常见的激活方式为点突变，突变的位点几乎都集中在2号外显子12、13密码子，常见的热点突变有7种，分别为K-ras基因第12密码子的六种突变类型(GAT，GCT,GTT, GAC, TGT, AGT, CGT)和第13密码子的一种突变类型(GAC)。P21蛋白作为EGFR信号通路的分子开关，参与细胞内的信号传递。正常情况下，P21蛋白不存在活性，能控制调控细胞生长的路径；当K-ras基因突变时，P21蛋白构象发生异常，在细胞受到外界刺激后激活EGFR等信号通路时，P21蛋白被活性EGFR等酪氨酸激酶磷酸化后而活化，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。进一步研究发现，多数人类肿瘤中均有K-ras基因的突变激活，其中最常见于胰腺癌、结肠癌和肺癌。K-ras基因在很多癌中都发生了突变，约30_50%的直肠癌，90%以上的胰腺癌，10-20%的肺癌。靶向药物的疗效往往与其靶向分子的信号通路的相关基因状态有关，如靶向药物爱必妥(Erbitux)和帕尼单(Panitumumab)与K_ras基因突变相关。K_ras基因突变与大肠癌等肿瘤患者酪氨酸激酶抑制剂等靶向药物的原发性耐药有关。K-ras基因野生型的患者能从爱必妥(Erbitux,又称西妥昔单抗/Cetuximab)或维克替比(Vectibix,又称帕尼单抗/Panitumumab)治疗中获益，而K_ras基因突变的大肠癌患者治疗效果较差。欧洲药监局和美国FDA明确规定了在使用靶向药物爱必妥和维克替比治疗转移性大肠癌前必须检测K-ras基因。因此，对于K-RAS基因突变检测有利于为患者个体用药提供用药科学依据，降低治疗风险以及患者负担。目前，针对K-ras突变检测的方法有为传统的sanger测序法，然而测序法存在很多缺点，包括(I)检测周期长，从样本DNA的抽提到得出检测报告要1-2天的时间。(2)操作过程复杂，并且要进行PCR扩增后操作，容易导致污染。(3)测序结果判读复杂，需要有经验的人才能准确判读，样本量大时，尤为突出。(4)检测灵敏度不高，出现假阳性的比例很高。(5)单次检测样本量很有限。(6)存在不安全性，实验过程中存在很多的有毒物质，如EB、丙烯酰胺，对操作者有危害。(7 )检测费用比较高。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、操作简单的人类K-ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。本专利技术只需设计一个PNA就可以抑制野生型DNA的扩增，通过一次反应即可区别野生型和突变型DNA，通过7种不同ARMS引物识别7种不同的突变类型，再通过实时定量PCR相结合，可对K-ras基因突变进行实时定量。本专利技术的目的是这样实现的 一种人类K-ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR混合反应液、肽核酸探针、taqman-MGB探针、用于K_ras基因突 变检测的内控正反向引物和探针、用于K_ras基因突变检测的外控正反向引物和探针，以及阳性对照品。所述肽核酸(PNA)探针的序列为SEQ ID NO :I所示，用来抑制K_ras基因野生型基因的扩增。SEQ ID NOl =H2N -CTACGCCACCAGCTC_CON2H 所述PCR混合反应液中含PCR正向引物和反向引物，所述PCR正向引物选自如下所示序列的一种或多种SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8，所述PCR反向引物的序列为SEQ ID NO :9所示。SEQ ID N02 :5’ -AACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA-3’SEQ ID N03 :5’ -ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3’SEQ ID N04 :5’ -CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3’SEQ ID N05 :5’ -AACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’SEQ ID N06 :5’ -CTTGTGGTAGTTGGAGCTC-3’SEQ ID N07 :5’ -ACTTGTGGTAGTTGGAGCTT-3’SEQ ID N08 :5’ -TTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGA-3’SEQ ID N09 :5’ -CAAGATTTACCTCTATTGTT-3’ 其中 SEQ ID N02是检测K-ras基因12密码子GGT-GAT的置换突变； SEQ ID N03是检测K-ras基因12密码子GGT-GCT的置换突变； SEQ ID N04是检测K-ras基因12密码子GGT-GIT的置换突变； SEQ ID N05是检测K-ras基因12密码子GGT-AGT的置换突变； SEQ ID N06是检测K-ras基因12密码子GGT-CGT的置换突变； SEQ ID N07是检测K-ras基因12密码子GGT-TGT的置换突变； SEQ ID N08是检测K-ras基因13密码子GGC-GAC的置换突变。所述taqman-MGB探针的序列如SEQ ID NO 10所示。SEQ ID NOlO 5’ -FAM-GAGTGCCTTGACGAT-MGB-3’ 所述用于K-ras基因突变检测的内控正反向引物和探针的序列分别如SEQ ID NO=IUSEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 所示。SEQ ID NOll :5’ -CCTGTCTCTTGGATATTCTC-3’SEQ ID N012 :5’ -AGTCCTCATGTACTGGTC-3’SEQ ID N013 :5’ -FAM-ACTCCTCTTGACCTGCTGTGT-TAMAR-3’ 所述用于K-ras基因突变检测的外控正反向引物和探针的序列分别如SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15, SEQ ID N0:16 所示。SEQ ID N014:5，-GGATTAGAGCAGTGGAGT-3，SEQ ID N015 :5’ -TCGGTAGTGGTGGTGCTGGGA-3’SEQ ID N016 :5’ -FAM-ACAGAAGGCTGTGGAGTC-TAMAR-3’ 所述阳性对照品是存在K-ras基因第12密码子六种突变类型(GAT，GCT, GTT, GAC,TGT, AGT, CGT)的质粒基因组DNA或/和第13密码子一种突变类型(GAC)的混合质粒基因组 DNA。一种人类K-ras基因突变分型荧光定量的PCR检测方法，包括以下步骤在含有PCR反应液的反应体系中加入PCR引物、肽核酸探针、taqman-MGB探针、用于K_ras基因突变检测的内控正反向引物和探针、用于K-ras基因突变检测的外本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人类K？ras基因突变分型荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括PCR混合反应液、肽核酸探针、taqman？MGB探针、用于K？ras基因突变检测的内控正反向引物和探针、用于K？ras基因突变检测的外控正反向引物和探针，以及阳性对照品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：段卫涛，喻德华，赵平锋，
申请(专利权)人：武汉海吉力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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