一种中药注射液致敏性的检测评价方法技术

本发明专利技术提供了一种中药注射液致敏性的检测评价方法，该方法是将中药注射液制剂经1至3KD超滤富集制备致敏性的大分子部位，然后将大分子部位加入到单个核细胞(PBMC)溶液中，共培养1至3天，然后采用优选的台盼蓝或荧光染料染色活细胞数目，以计算、评价中药注射液的致敏性强度。该方法具有方便、快捷和灵敏的优势，可广泛适用于各种中药注射液致敏性、刺激性的评价和检验，可为中药注射液的安全性评价，中药注射液的质量控制，为保证临床用药的安全性，提供科学的依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测方法，具体设计一种广泛适用于中药注射液致敏性、刺激性的检测评价方法。
技术介绍
中药注射液是中药现代化发展中开发出来的一种现代中药制剂，临床使用疗效显著，广泛用于呼吸、心脑血管等领域，并取得了良好的市场经济效益。但是中药注射液在临床使用时经常有不良反应发生，具有安全隐患。临床经常使用的中药注射液品种，如双黄连、清开灵、板蓝根、鱼腥草、穿琥宁、脉络宁、葛根素、复方丹参等品种，均有不良反应报道。不良反应类型多样，最常发生的是药物性过敏。例如，双黄连注射液中金银花含有绿原酸、清开灵中的角类成分容易造成过敏。溶血反应也常见于中药注射液不良反应，例如 鱼腥草注射液中吐温-80超标容易引起溶血。此外，还涉及神经系统、消化系统、心血管系统、感觉器官、泌尿系统、皮肤及其附件等多个系统的不良反应。严重限制了该类品种的用药安全和新药开发。对于中药注射液中致敏性物质，有效的检验和检测方法对于控制其不良反应至关重要，但是当前尚缺乏高效灵敏的化学检测方法。因此，很有必要在现有技术的基础之上研究开发出一种可靠有效的中药注射液致敏性、刺激性的检测评价方法。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术不能有效检测中药注射液中致敏性的不足，提供一种适用范围广泛，高效、稳定，操作方便、快捷，结果准确的中药注射液致敏性、刺激性的检测方法。技术方案为了实现以上目的，本专利技术采取的技术方案为(I)使用截留分子质量为IKD至3KD超滤膜富集中药注射液中具有刺激性的大分子部位，备用；(2)将步骤(I)制备得到的刺激性的大分子部位加入到脏器或外周血液来源的单个核细胞(PBMC)中，共培养I至3天；(3)取步骤(2)培养后的单个核细胞采用台盼蓝染液染色或荧光染料染色，计数细胞的数目或功能状态来检测和评价中药注射液的致敏性。作为优选方案，以上所述的中药注射液致敏性的检测评价方法，步骤(I)中药注射液富集的倍数为I至10000倍，作为更优选的技术方案，本专利技术中药注射液富集的倍数为20至60倍。作为优选方案，以上所述的中药注射液致敏性的检测评价方法，步骤(2)刺激性的大分子部位加入到脏器或外周血液来源的单个核细胞(PBMC)中培养2至3天。本专利技术通过大量实验筛选刺激性的大分子部位在单个核细胞(PBMC)中培养时间，实验结果表明，当培养48至72小时小时，能够使单个核细胞在刺激性的致敏原下，细胞增殖达最高。作为优选方案，以上所述的中药注射液致敏性的检测评价方法，其中所述的单个核细胞PBMC细胞可以是人源或其它实验动物来源，可来自外周血液或脏器的免疫细胞。作为优选方案，以上所述的超滤膜可以使用工业超滤膜，也可使用商业的超滤离心管，中药制剂在生产和存放过程中可能产生微量的致敏物质，研究需要高浓度的致敏物质。而超滤是一种有效排除小分子干扰的技术，而且3KD的超滤管可截留并富集到高浓度致敏物，具有损耗小、效率高、操作便捷的优点。中药注射液制剂致敏性的检测方法是一个关键性的问题，本专利技术提供的中药注射液致敏性的检测评价方法，创造性的采用单个核细胞PBMC激活为模型，PBMC细胞含有抗原递呈细胞，可识别并加工致敏原及类过敏原(如鞣质)与血清蛋白结合成全抗原的抗原信息，并递呈给PBMC中的T、B淋巴细胞。最后通过细胞数量或活力测定来评价注射液致敏物的刺激性，具有操作可靠性强，实验稳定性好等优点。本专利技术提供的中药注射液致敏性的检测评价方法，由于富集的大分子部位有较深 的颜色，采用MTT法检测细胞活性有明显干扰，误差较大，实验结果不准确。本专利技术通过大量实验筛选，采用台盼蓝和荧光染色测定PBMC细胞活力；作为优选方案，荧光探针可以是Hochest, PI等多种荧光探针，优化的检测方法是用荧光显微镜或荧光酶标仪检测，具有检测灵敏，高效的优点。有益效果本专利技术提供的中药注射液致敏性的检测评价方法和现有技术相比，具有以下优点本专利技术提供的中药注射液致敏性的检测评价方法，通过大量实验，优选出大分子的富集倍数，创造性的采用单个核细胞PBMC为激活模型，并优选出大分子致敏性物质在单个核细胞PBMC中的培养时间，并采用优选的台盼蓝染液染色或荧光染料染色法来计数细胞的数目或功能状态，具有可操作性强，方便、快捷、高效、检测结果准确，可广泛适用与各种中药注射液，中间体等的致敏性的检测评价，克服了现有技术中致敏性的检测的诸多不足，本专利技术可为中药注射液的安全性评价，中药注射液的质量控制，为保证临床用药的安全性，提供科学的依据，具有重要的社会效应。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐明本专利技术，应理解这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，在阅读了本专利技术之后，本领域技术人员对本专利技术的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。实施例I热毒宁注射液致敏性检测一、方法I、超滤富集中药注射液致敏性部位分别取已知出现不良反应的热毒宁注射液(批号100808、111011、101105、101114)和待测样品的热毒宁注射液(批号:110709、120207、120210、120211)各100ml，分别加入到截留分子量为3KD的超滤管，3500转离心40min，经反复超滤，剩余5ml溶液，分别得到以上各批号的20倍浓缩富集的大分子致敏性部位，灭菌，4度保存。2、脾单个核细胞PBMC与刺激性部位共培养取ICR小鼠断头处死，放置在75%酒精中浸泡2分钟后取出，打开腹腔取出脾脏，置于培养皿中，剪碎后用针芯挤压分散，用PBS (5ml)吹打分散为细胞悬液，然后过300目滤网，然后与等量PBS溶液混匀，过筛液1500转/分钟离心10分钟，弃上清后加入2ml红细胞裂解液混匀后，在1000转/分钟离心8分钟，弃上清后加入PBS，混匀后1000转/分钟离心8分钟，并重复一次，弃上清液得脾单个核细胞PBMC，数细胞数并复溶于全培(10%胎牛血清的1640)，计数备用。调节PBMC浓度为I X 106cells/ml，以100 U 1/well接种于96孔细板，加入I富集得到的不同批号的热毒宁注射液的致敏性大分子部位20 yl，对照组加入20 Ul注射用水，IOiU胎牛血清和70 ill的10% 1640。然后将96孔细板放置37°C、5% C02条件下培养72h。 3、致敏性检测取与刺激性部位共培养的脾单个核细胞PBMC，进行台盼蓝染色和Hochest33342荧光染色。台盼蓝染色每孔中加入0. 04%台盼蓝染液20 iU，混合5分钟，混匀后，吸取20 u I加入血球计数板计数活细胞数目。荧光染色1. 5ml离心管收集培养72h后的PBMC，加入5 U g/ml的Hochest33342，在37°C、5% C02培养30min后，1500转/分钟离心5min，PBS洗涤细胞，涂于载玻片，荧光显微镜观察。以中药注射液对细胞刺激性倍数来反映其致敏性的强弱。 刺激性倍数=(中药制剂组细胞数-对照组细胞数)/对照组细胞数二、结果对已知具有临床不良反应出现的成品进行20倍的超滤浓缩，采用上述建立的PBMC致敏性检测方法检测。结果表明，与正常对照组比较，已知出现不良反应的热毒宁(批号:100808、111011、101105、101114)均有显著的刺激性(**P <本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中药注射液致敏性的检测评价方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)使用截留分子质量为1KD至3KD超滤膜富集中药注射液中具有刺激性的大分子部位，备用；(2)将步骤(1)制备得到的刺激性的大分子部位加入到脏器或外周血液来源的单个核细胞中，共培养1至3天；(3)取步骤(2)培养后的单个核细胞采用台盼蓝染液染色或荧光染料染色，计数细胞的数目或功能状态来检测和评价中药注射液的致敏性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马宏跃，段金廒，詹瑧，萧伟，王团结，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：