一种Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体，N-端为Ⅰ型人胶原蛋白编码序列，C-端为人表皮生长因子编码序列，两段肽段之间用α信号肽切割位点Lys-Arg-Glu-Ala连接，建立人表皮生长因子和胶原蛋白双表达体系。表达纯化方法包括基因的获得、载体pPIC9K与Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子的连接、毕赤酵母电转化、多拷贝插入重组子的筛选、Ⅰ型人胶原蛋白-表皮生长因子的发酵表达、Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子的纯化步骤。本发明专利技术利用胶原蛋白在毕赤酵母的高表达特性，引导融合人表皮生长因子的高表达，在蛋白酶作用下，切割成两个独立的单体蛋白，通过纯化，获得基因重组人表皮生长因子及Ⅰ型人胶原蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及到同时表达两种蛋白的重组载体。
技术介绍
胶原蛋白(collagen)是广泛分布于动物结缔组织的一组蛋白质家族,也是体内含量最多的一种蛋白质，约占蛋白质总量的25% 33%，其对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用。胶原蛋白作为天然的生物资源，具有合成高分子材料无法比拟的生物相容性和生物可降解性，可广泛应用在医药、化妆品等工业中。目前，胶原蛋白已经成功地在多种宿主细胞中得到表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母、大肠杆菌、转基因烟草、小鼠和蚕等，尤其在毕赤酵母中胶原蛋白有极高的分泌表达特性，最高达14. 8g/L。 本公司2011年研究表明I型与III型胶原蛋白在毕赤酵母中融合表达，表达量达10g/L以上，并成功申报专利，专利申请号为201010527766. 7。表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)是在1962年由Cohen从小鼠颌下腺分离得到，人表皮生长因子又称抑胃素，是存在于人体内的一种具有广泛的生物学功能的多肽生长因子，且具有难透析、耐热、不被胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶消化的理化特性。表皮生长因子是由53个氨基酸组成的单链多肽，活性中心位于48-53个氨基酸残基之间，一级结构不含丙氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸，二级结构排列紧秘，稳定性强，相对分子量为604 a，等电点PI为4. 6，含3个链内二硫键，二硫键为其生物活性所必需。表皮生长因子具有促有丝分裂和非促有丝分裂二重活性，能刺激外胚层、中胚层和内胚层细胞增殖和分化，促进组织生长、发育和成熟。表皮细胞上有丰富的表皮生长因子受体(EGFR)，表皮生长因子与细胞膜上的受体结合后，通过受体的自磷酸化，激活蛋白G和磷酸脂酶C等一系列生化反应，改变细胞内的钙离子浓度，从而向核内传递增殖信号，诱导核内基因表达加强，促进糖酵解及蛋白质、RNA和DNA的合成，从而促使细胞分裂和增殖。实验研究表明，外源性表皮生长因子对多种组织来源的上皮及表皮细胞有较强的促有丝分裂活性。表皮生长因子能刺激角膜上皮和内皮增殖，促进角膜内皮细胞迁移、滴眼给药可明显加快角膜创伤的愈合。表皮生长因子也能刺激皮肤表皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞等的增殖，促进各种皮肤创伤的愈合和修复，加速移植皮肤的生长和愈合。表皮生长因子还能抑制胃酸分泌，促进胃、十二指肠溃疡的愈合，防治胃溃疡及胃酸分泌过多症。随着对表皮生长因子研究的不断深入和在临床上应用的日益广泛，市场对表皮生长因子的需求量越来越高，目前，最适合大规模生产表皮生长因子的方法是利用基因重组技术转化大肠杆菌、酵母等，但由于生产困难及产量较低使表皮生长因子的价格居高不下，1992年，中科院上海生化所构建E. coli碱性磷酸酶启动子及信号肽序列表皮生长因子基因的pAE-8质粒，转化该酶缺失的E. coli变异株K539，得表达菌株EEB，表皮生长因子产量I. 5mg/L ; 1993年，人们利用OmpA构建出了 pETacECF质粒，使表皮生长因子分泌至胞外，最高产量可达300mg/L和391mg/L。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题在于克服上述基因重组人表皮生长因子表达量低的缺点，提供一种I型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体。本专利技术所要解决的另一个技术问题在于提供一种简单、有效的I型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体的构建方法。解决上述技术问题采用的技术方案是该I型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体插入的外源序列氮端为I型人胶原蛋白的600个氨基酸，碳端为表皮生长因子的53个氨基酸，在I型人胶原蛋白上游添加PPIC9K载体自身a信号肽切割位点和用于连接载体的亮氨酸和谷氨酸，在表皮生长因子上游添加PPIC9K载体自身a信号肽切割位点和用于连接I型人胶原蛋白的谷氨酸和苯丙氨酸，该I型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体的氨基酸序列如下I LEKREAGVAG PKGPAGERGS PGPAGPKGSP GEAGRPGEAG LPGAKGLTGS PGSPGPDGKT61 GPPGPAGQDG RPGPPGPPGA RGQAGVMGFP GPKGAAGEPG KAGERGVPGP PGAVGPAGKD121 GEAGAQGPPG PAGPAGERGE QGPAGSPGFQ GLPGPAGPPG EAGKPGEQGV P⑶LGAPGPS181 GARGERGFPG ERGVQGPPGP AGPRGANGAP GNDGAKGDAG APGAPGSQGA PGLQGMPGER241 GAAGLPGPKG DRGDAGPKGA DGSPGKDGVR GLTGPIGPPG PAGAP⑶KGE SGPSGPAGPT301 GARGAP⑶RG EPGPPGPAGF AGPPGADGQP GAKGEPGDAG AKGDAGPPGP AGPAGPPGPI361 GNVGAPGAKG ARGSAGPPGA TGFPGAAGRV GPPGPSGNAG PPGPPGPAGK EGGKGPRGET421 GPAGRPGEVG PPGPPGPAGE KGSPGADGPA GAPGTPGPQG IAGQRGVVGL PGQRGERGFP481 GLPGPSGEPG KQGPSGASGE RGPPGPMGPP GLAGPPGESG REGAPGAEGS PGRDGSPGAK541 ⑶RGETGPAG PPGAPGAPGA PGPVGPAGKS ⑶RGETGPAG PAGPVGPVGA RGPAGPQGPR601 GDKGETEFKR EANSDSECPL SHDGYCLHDG VCMYIEALDK YACNCVVGYI GERCQYRDLK661 WffELR本专利技术的pPIC9K载体自身a信号肽切割位点氨基酸序列为LyS-Arg-Glu_Ala。本专利技术的表皮生长因子的核苷酸序列为I AATTCTGATT CTGAATGTCC TTTGTCCCAC GATGGTTACT GCTTGCATGA TGGTGTCTGC61 ATGTATATTG AAGCATTGGA TAAGTATGCT TGTAACTGTG TTGTTGGCTA CATCGGTGAG121 AGATGTCAGT ACAGAGACTT GAAGTGGTGG GAATTGAGAT AA上述的I型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体的表达纯化方法由下述步骤组成I、基因的获得从离体的人胎盘中提取总RNA，反转录获得cDNA，设计I型人胶原蛋白(COLl)基因PCR扩增引物，引入限制性酶切位点Xho I ,EcoR I和pPIC9K载体自身a信号肽切割位点序列AAACGAGAAGCT，引物序列为F: CGCTCGAGAAACGAGAAGCTGGTGTTGCTGGTCCCA、R: CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG采用PCR方法扩增获得I型人胶原蛋白基因。重新设计并合成表皮生长因子核苷酸序列，添加限制性内切酶酶切位点EcoR I、Not I和pPIC9K载体自身a信号肽切割位点序列AAACGAGAAGCT，表皮生长因子(EGF)核苷酸序列如下I GAATTCAAAC GAGAAGCTA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体，其特征在于：插入的外源序列氮端为Ⅰ型人胶原蛋白的600个氨基酸，碳端为表皮生长因子的53个氨基酸，在Ⅰ型人胶原蛋白上游添加pPIC9K载体自身α信号肽切割位点和用于连接载体的亮氨酸和谷氨酸，在表皮生长因子上游添加pPIC9K载体自身α信号肽切割位点以及用于连接Ⅰ型人胶原蛋白的谷氨酸和苯丙氨酸，该Ⅰ型人胶原蛋白？表皮生长因子的氨基酸序列如下：1？？？？？？？？LEKREAGVAG？PKGPAGERGS？PGPAGPKGSP？GEAGRPGEAG？LPGAKGLTGS？PGSPGPDGKT61？？？？？？？GPPGPAGQDG？RPGPPGPPGA？RGQAGVMGFP？GPKGAAGEPG？KAGERGVPGP？PGAVGPAGKD121？？？？？？GEAGAQGPPG？PAGPAGERGE？QGPAGSPGFQ？GLPGPAGPPG？EAGKPGEQGV？PGDLGAPGPS181？？？？？？GARGERGFPG？ERGVQGPPGP？AGPRGANGAP？GNDGAKGDAG？APGAPGSQGA？PGLQGMPGER241？？？？？？GAAGLPGPKG？DRGDAGPKGA？DGSPGKDGVR？GLTGPIGPPG？PAGAPGDKGE？SGPSGPAGPT301？？？？？？GARGAPGDRG？EPGPPGPAGF？AGPPGADGQP？GAKGEPGDAG？AKGDAGPPGP？AGPAGPPGPI361？？？？？？GNVGAPGAKG？ARGSAGPPGA？TGFPGAAGRV？GPPGPSGNAG？PPGPPGPAGK？EGGKGPRGET421？？？？？？GPAGRPGEVG？PPGPPGPAGE？KGSPGADGPA？GAPGTPGPQG？IAGQRGVVGL？PGQRGERGFP481？？？？？？GLPGPSGEPG？KQGPSGASGE？RGPPGPMGPP？GLAGPPGESG？REGAPGAEGS？PGRDGSPGAK541？？？？？？GDRGETGPAG？PPGAPGAPGA？PGPVGPAGKS？GDRGETGPAG？PAGPVGPVGA？RGPAGPQGPR601？？？？？？GDKGETEFKR？EANSDSECPL？SHDGYCLHDG？VCMYIEALDK？YACNCVVGYI？GERCQYRDLK661？？？？？？WWELR...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高恩，侯增淼，李哲，赵真虎，赵金礼，
申请(专利权)人：陕西东大生化科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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