本发明专利技术属于作物分子育种技术领域。具体涉及一种油菜隐性核不育恢复基因BnaC.Tic40的分离克隆、功能验证和应用。本发明专利技术分离的甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnaC.Tic40，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，它编码的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。分离的甘蓝型油菜隐性雄性不育基因BnaA.Tic40-1，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：4所示。本发明专利技术还公开了所述的基因在甘蓝型油菜细胞核雄性不育遗传改良中的应用。利用分子标记技术定位和克隆恢复基因BnaC.Tic40，可以加快油菜等作物隐性细胞核雄性不育系和临保系的选育，从而在繁殖制种时获得100％不育的群体，突破核不育系在油菜等作物杂种优势利用中的瓶颈。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于油菜育种
具体涉及一个油菜隐性核不育恢复基因BnaC.Tic40 (BnMs3)的分离克隆、功能验证和应用。本专利技术涉及的显性基因BnaC. Tic40是隐性核基因BnaA. Tic40-1 (Bnms3)的功能获得性变异的同源基因。恢复基因BnaC. Tic40的克隆、验证和应用可以加快油菜等作物隐性细胞核雄性不育系和临保系的选育，从而在繁殖制种时获得100%不育的群体。
技术介绍
植物在有性繁殖的过程中不能产生正常花粉的遗传现象称为雄性不育，它涉及到花器中雄蕊的发生与发育、绒毡层结构、小孢子形成、花药开裂以及外部生态环境等很多环节。雄性不育可以分为细胞质雄性不育(CMS)和细胞核雄性不育(GMS)。细胞质雄性不育为人类所知已有100多年的历史，并且在水稻、玉米、油菜等作物中广泛的用于生产杂交 种。目前，世界上可以用于油菜杂种优势利用的CMS系统有ogiukos、tour和波里马。其中，波里马CMS是目前国际上公认的最有实用价值的CMS系统(傅廷栋，杂交油菜的育种与利用，湖北科学技术出版社，2000)，但是波里马不育系育性受到温度的影响表现不稳定，制种风险较大，其应用受到了一定的限制。细胞核雄性不育系由于育性表现稳定，易于回交转育获得新的不育系，并且一般不受恢保关系的限制，近年来受到育种家的广泛关注。目前国内外利用的油菜核不育系主要有以下四种类型显性核不育、两对隐性基因控制的核不育、互作型核不育和转基因核不育。四川省宜宾地区农科所(1972)发现的宜3A是显性核不育系的典型代表，目前还没有选育出大面积推广的双低杂交组合。美国和加拿大利用烟草的TA29基因的启动子和核糖核酸水解酶(barnase)基因构建成融合基因转化甘蓝型油菜，人工创造了新的核不育材料，并通过向该材料中导入抗除草剂基因后达到了机械化作业。但是该系统的不足之处是必须对不育系和恢复系都进行转基因，该系统目前也受到专利的保护。S45A(潘涛等，1988)和117A(侯国佐等，1990)是两对隐性基因控制的核不育系的典型代表，由其选育而来的杂交种中已审定的有“蜀杂6号” “蜀杂7号”、“油研7号”、“油研8号”和“油研9号”等。这类系统主要缺点是不育系中存在50%的可育株，在制种时需要在初花期拔掉50%的可育株，由此不仅增加了制种的成本，而且往往由于可育株清除不彻底，影响制种纯度，增加了生产的风险。9012A (陈凤祥等，1998)和7365A(Huang et al.，2007)均属于隐性上位互作型核不育系，以其为材料选育的品种中，已审定的杂交种有“皖油14号”、“皖油18号”(陈凤祥等,2002 ；2003)和“沪油杂I号”(孙超才等，2004)等组合，该系统通过引入临保系犾得100%的全不育系，在油菜核不育系统研究领域取得了重大进展。但是这个系统遗传基础复杂、临保系选育困难，不利于选育强优势组合。克服隐性上位互作型核不育这个缺点的可行性策略是建立不育恢复基因和上位基因的分子标记体系，克隆恢复基因和上位基因，利用分子标记实现不育系的临保系的定向选择。而且，开展核不育恢复基因的克隆和功能研究，对促进核不育杂种优势利用，具有重大的理论意义和实用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克隆一个甘蓝型油菜核不育恢复新基因BnaC. Tic40，利用该基因恢复甘蓝型油菜隐性核不育系7365A、9012A的育性，或作为新的核不育系和临保系选育的分子标记，以加快甘蓝型油菜核不育系和临保系的选育。申请人:通过分离和克隆技术，从甘蓝型油菜中分离得到一种甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnaC. Tic40，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。分离得到一种甘蓝型油菜隐性雄性不育基因BnaA. Tic40_l，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 3所不；该基因编码的氣基酸序列如序列表SEQ ID NO 4所不。 可以采用已经克隆的多核苷酸作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本专利技术的基因或同源基因。同样，米用PCR(polymerase chain reaction)技术,也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本专利技术的基因以及任何感兴趣的一段多核苷酸或与其同源的一段多核苷酸。本专利技术为甘蓝型油菜细胞核雄性不育遗传改良提供了新用途，其中包括作为恢复甘蓝型油菜核不育系的育性；或作为新核不育系与临保系选育的分子标记。在本专利技术的实施例部分，申请人阐述了隐性基因BnaA. Tic40_l和显性基因BnaC.Tic40的分离、功能验证和应用过程以及这两个基因的特点。附图说明序列表SEQ ID NO :1.本专利技术分离的甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnaC. Tic40的核苷酸序列，来源于甘蓝型油菜核不育两型系中的可育株7365B。序列表SEQ ID NO :2.本专利技术分离的甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnaC. Tic40编码的蛋白质的氨基酸序列，来源于甘蓝型油菜核不育两型系中的可育株7365B。序列表SEQ ID NO :3.本专利技术分离的甘蓝型油菜隐性核不育基因BnaA. Tic40_l的序列，来源于甘蓝型油菜核不育两型系中的不育株7365A。序列表SEQ ID NO :4.本专利技术分离的甘蓝型油菜隐性核不育基因BnaA. Tic40_l编码的蛋白质的氨基酸序列，来源于甘蓝型油菜核不育两型系中的不育株7365A。图I.本专利技术鉴定、分离、克隆并验证甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnaC. Tic40和它的基因功能的流程图。图2.覆盖甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnaC. Tic40区段的物理图谱。图中空心线表示BnaC. Tic40基因精细定位的遗传图谱；分子标记下面的数字表示在近等基因系群体中检测到的BnaC. Tic40位点与分子标记之间发生重组交换的单株数；连接分子标记和BAC克隆的竖虚线表示通过序列比较分析证实了相对应的分子标记和BAC克隆具有同源性；实线表示细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)克隆和拟南芥染色体；线上的椭圆代表相应区域拟南芥基因组图谱上注释的基因；线上的黑点代表根据BAC序列预测的甘蓝型油菜基因。图3.候选基因启动子分析载体的结构。RB和LB =T-DNA的右侧和左侧边界；NOS-pro :N0S启动子APTII(Kanlr):新霉素磷酸转移酶II基因；N0S_ter :N0S终止子；(；US 葡萄糖醛酸糖苷酶基因。图4.拟南芥TO代遗传转化植株花蕾⑶S染色结果。只有恢复基因BnaC. Tic40的启动子分析载体PBIP4-GUS转化后的TO代遗传转化植株花蕾可看到明显的GUS着色信号。图5.甘蓝型油菜功能互补测验表达载体pC2300_BnaC. Tic40的构建图。图6.具有7365A遗传背景的TO代遗传转化甘蓝型油菜植株开花后育性表型与7365A和7365B表型的比较。7365A遗传转化TO代植株携带显性基因BnaC. Tic40的候选基因，表现为花丝伸长，育性恢复，花粉KI染色正常。图7.甘蓝型油菜隐性核不育系7365A半薄切片显微解剖结构。b、d、e、g、i、k和 m分别是正常花药花粉母细胞时期本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnaC.Tic40，其核苷酸序列如序列表SEQ？IDNO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：涂金星，顿小玲，傅廷栋，马超芝，沈金雄，易斌，文静，李兴华，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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