本发明专利技术公开了一对用于快速检测葡萄溃疡病菌Neofusicoccum?parvum菌种的引物及其应用。该对引物，它们的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2，能够在葡萄溃疡病菌Neofusicoccum?parvum特异性的扩增出370bp的产物，对Neofusicoccum?parvum菌种基因组DNA的灵敏度可达10pg。这表明该引物对可以用于田间葡萄病样中Neofusicoccum?parvum菌种的快速可靠的检测和鉴定，克服传统鉴定方法步骤繁琐、鉴定周期长等问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一对葡萄溃瘍病菌Neofusicoccum parvum菌种快速分子检测引物及其应用。
技术介绍
葡萄溃瘍病(Grape Botryosphaeriaceae Canker)是由葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)真菌侵染引起的一种病害，近年来在世界范围内危害日益加重， 在埃及、美国、匈牙利、意大利、葡萄牙、西班牙、南非和中国等14个国家均有发生并造成了严重的损失。目前，已知葡萄座腔菌科中的15个种能够引起该病害(Auger J, EsterioM,Ricke G，et al. Black dead arm and basal canker of Vitis vinifera cv. Red Globecaused by Botryosphaeria obtusa in Chile . Plant Disease. 2004, 88(11):1286.Niekerk J M，Fourie P H，Hallenn F，et al. Botryosphaeria spp.as grapevinetrunk disease pathogens . Phytopathologia Mediterranea. 2006，45(4):43-54.U Rbez-Torres J R，Peduto F，Striegler R K，et al.Characterization of fungalpathogens associated with grapevine trunk diseases in Arkansas and Missouri.Fungal Diversity. 2012:1-21. U Rbez-Torres J R，Gubler W D.Pathogenicity ofBotryosphaeriaceae species isolated from grapevine cankers in California.Plant Disease. 2009，93 (6) : 584-592.)，在我国已发现并报道的葡萄溃疡病病原菌有 Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae 和 Diplodia seriata 三个种(Li X H，Yan JY, Kong F F，et al. Botryosphaeria dothidea causing canker ofgrapevine newly reported in China . Plant Pathology.2010, 59 (6):1170. YanJ Y，Peng Y L，XieY，et al. First Report of Grapevine Trunk Disease Caused byBotryosphaeria obtusa in China. Plant Disease. 2011, 95 (5):616. Yan J Y，Li XH，Kong F F，et al. Occurrence of Grapevine Trunk Disease Caused by Botryosphaeriarhodina in China Plant Disease. 2011，95 (2):219.Yan JY, XieY, Yao S W, etal.Characterization of Botryosphaeria dothidea, the causal agent of grapevinecanker in China. Australasian Plant Pathology. 2012，41:351-357.)。现阶段对于病原菌真菌的鉴定，以常规的形态学鉴定为主，但由于葡萄溃疡病菌种类繁多且种间形态差异较小，使得传统鉴定方法耗时耗力，迫切需要现代分子技术手段解决该问题。近年来，以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)技术为平台的病原生物分子检测技术，已被广泛应用于动植物病害的诊断及病原菌的鉴定。但在葡萄溃疡病菌检测方面，国内至今还未有分子检测技术的系统研究。葡萄溃疡病菌的快速检测技术，有助于了解我国葡萄溃疡病菌的种群分布，对葡萄溃疡病的有效防治及葡萄抗病品种的选育等方面有指导作用
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一对葡萄溃瘍病菌Neofusicoccum parvum菌种特异性分子检测引物以及特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的葡萄溃疡病菌的快速分子检测方法。本专利技术所提供的快速检测葡萄溃瘍病菌Neofusicoccum parvum菌种的引物,名称为B. p-F/B. p-R，它们的核苷酸序列分别为序列表中序列I和序列表中序列2。本专利技术还提供一种快速检测葡萄溃瘍病菌Neofusicoccum parvum菌种的试剂盒，包括上述引物。所述试剂盒还可以包括PCR反应试剂盒。PCR反应试剂盒可以从商业途径获得，也可以自己配置。 本专利技术还提供利用上述检测引物B. p-F/B. p-R检测葡萄溃瘍病菌Neofusicoccumparvum菌种的方法,包括以下步骤I)提取待测样品DNA，以该DNA为模板，用权利要求I所述的引物进行PCR扩增；2)鉴定步骤I)所述的PCR扩增产物的大小，将扩增产物中含有一个370bp的DNA特异性扩增片段的待测样品鉴定为含有Neofusicoccum parvum菌种的样品。PCR反应体系为25ii L，包括待测样品DNA (约5ng)，上游正向引物和下游反向引物(10iimol/L)各0. L(即终浓度为 0. 2iimol/L)，dATP、dCTP、dGTP、dTTP 的终浓度均为 2. 5mmol/L, 2. 5 u L10父？0 缓冲液(100_01/1 Tris-HCl pH8. 3, 500mmol/LKCl, 15mmol/L MgCl2)和 0. 25 y LTaq DNA聚合酶(5U/iiL，添加终浓度为0.05U/iil)，其余部分用ddH20补足；PCR 条件为94°C预变性 4min ；30 个循环的 94°C 45s，61。。30s 和 72°C 30s ；72°C延伸IOmin0步骤2)中所述鉴定步骤1)PCR扩增产物的大小的方法是取5 ii L PCR产物用质量百分浓度为I. 2%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据有无扩增产物判定结果。扩增产物中含有一个370bp的DNA片段的待测葡萄溃瘍病菌(Botrysphoraeriaspp.)菌株为属于Neofusicoccum parvum菌种的菌株。所述待测样品DNA采用NaOH法提取，DNA提取步骤如下I)将待测样品称重后，每mg样品加入30 ii L 0. 5mol/LNa0H溶液，充分研磨；2)将步骤I)研磨后的样品离心取上清液，每IOii L上清液加入490 ii L 0. ImmoI/LpH8. 0的Tris-HCl，混匀后得到待测样品DNA，直接用于PCR反应。上述引物可应用于筛选引起葡萄溃疡病的病原菌,特别是筛选葡萄座腔菌属菌种Neofusicoccum parvum,而且可本文档来自技高网...
【技术保护点】
一对引物，它们的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张玮，李兴红，燕继晔，严红，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：
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