一种H2O2诱导的NIH-3T3细胞衰老模型。本发明专利技术属于研究获得简单、快速的动物模型来检验抗衰老药物的疗效。采取如下的技术方案：将NIH-3T3细胞接种在含10%胎牛血清的MEM，在温度37℃、饱和湿度的培养箱中培养；从20代开始，细胞随机分3组后细胞培养，3-4天换液1次，细胞达到融合时，用0.025%胰酶后1:4传代，细胞至30代时随机收获部分细胞；将H2O2用DMEM完全培养液按不同浓度梯度稀释后，加入细胞中，形成浓度梯度，培养2小时后，弃去。用PBS或DMEM洗三遍，加入DMEM完全培养液继续培养；在连续培养到第十天，用胰酶消化6孔板中细胞，取其中5000个细胞接种到24孔板中培养24小时得抗衰老动物模型。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于研究抗衰老研究领域如何获得一种简单、快速的生物模型，以此来检验抗衰老药物的疗效。
技术介绍
随着社会的发展，人类寿命普遍延长，高龄老人明显增多，人口老龄化问题日益严重，已经成为当今世界普遍关注的焦点。因此如何检测抗衰老药物的疗效，是一个迫切需要解决的现实问题
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是获得一种简单、快速的生物模型，以此来检验抗衰老药物的疗效。为解决以上问题，本专利技术采取如下的技术方案 将NIH-3T3细胞接种在含10%胎牛血清的MEM，在温度37°C、饱和湿度的培养箱中培养；从20代开始，细胞随机分3组后细胞培养，3-4天换液I次，细胞达到融合时，用0. 025%胰酶后1:4传代，细胞至30代时随机收获部分细胞；将H2O2用DMEM完全培养液按不同浓度梯度稀释后，加入细胞中，形成0，300，600，1000，1500，2000 u M浓度梯度，培养2小时后，弃去。用PBS或DMEM洗三遍，加入DMEM完全培养液继续培养；在连续培养到第十天，用胰酶消化6孔板中细胞，取其中5000个细胞接种到24孔板中培养24小时，用细胞衰老P -半乳糖苷酶染色试剂盒染色细胞，在高倍显微镜下观察，染上蓝色的细胞即是衰老细胞。小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3 )细胞株是目前国际上公认于体外研究细胞复制衰老的模型。复制衰老是指体外连续培养的细胞在完成有限次数的细胞分裂后，丧失合成DNA及分裂的能力，最后导致细胞不能进行增殖，但仍能维持细胞的基本代谢程的一种现象。本专利技术采取过氧化氢通过氧化应激的方法来诱导细胞衰老，建立NIH-3T3细胞衰老模型。与已有的报道相比，本专利技术具有简单、快速、试剂成本低廉的有益特点。。具体实施方式。实施例I、材料与方法 1.1空白血清制备取清洁级SD大鼠(240g左右)10只，麻醉腹主动脉采血，4°C过夜,3000转/ min离心10分钟,小心分离血清,于56°C下30 min灭活,经0. 22 y m滤膜滤过除菌，_20°C保存。I. 2细胞培养及分组NIH-3T3细胞(胚胎成纤维细胞)由美国ATCC细胞库提供。细胞接种在含10%胎牛血清(美国Invitrogen公司)的MEM (美国Invitrogen)培养,在温度37°C、饱和湿度的培养箱中培养。从20代开始，细胞随机分成3组年轻组(20代细胞)、空白对照组(空白血清+ H2O2处理)、模型组(H2O2处理)。然后细胞培养，3-4天换液I次，细胞达到融合时，用0. 025%胰酶后1:4传代，细胞至30代时随机收获部分细胞作各项实验。1.3 H2O2刺激细胞将H2O2用DMEM完全培养液按不同浓度梯度稀释后，加入细胞中，形成0,300,600,1000,1500，2000 u M浓度梯度，培养2小时后，弃去。用PBS或DMEM洗三遍，加入DMEM完全培养液继续培养。I. 4在连续培养到第十天，用胰酶消化6孔板中细胞，取其中5000个细胞接种到24孔板中培养24小时，用碧云天公司的细胞衰老P -半乳糖苷酶染色试剂盒染色细胞。 I. 5在高倍显微镜下观察染色细胞，染上蓝色的细胞即是衰老细胞。I. 6计数数出400个细胞及其中含有的衰老细胞，即可得出该H2O2浓度作用下的细胞衰老比例。2、结果 2.I细胞的形态变化年轻组细胞的细胞体呈梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2-3个长短不同的突起，中央有卵圆形核，核仁清晰可见。空白对照组细胞体呈长梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2-3个长短不同的突起，细胞体积较年轻组增大，部分细胞胞浆内的颗粒增多。模型组的细胞形态不规则，绝大多数的细胞体积明显增大，胞体变平，核浆比例缩小，胞浆内的颗粒丰富。2.2 ￠-半乳糖苷酶细胞化学染色P -半乳糖苷酶染色阴性细胞的细胞核复染为红色，而阳性细胞的胞浆染为青绿色。年轻组￠-半乳糖苷酶染色阳性细胞数的百分比为2. 00± I. 00%，空白对照组￠-半乳糖苷酶染色阳性细胞数的百分比为2. 624±0. 208%,模型组￠-半乳糖苷酶染色阳性细胞数最多，其百分比为75. 00±2. 64%。模型组的￠-半乳糖苷酶染色阳性细胞数比年轻组、空白对照组高(P〈0. 01)。从表5-1可以看出，不同浓度H2O2刺激下，细胞增殖随浓度递增而呈梯度抑制。表5-1 NIH-3T3细胞受不同浓度H2O2刺激下细胞增殖情况 浓度 0SOnM 1150 pH I 300 IfiOO p,M IlOOO p,Mg 孔______ ^_ I 74 I 39 1.38 0.89 0 66 0 53 I^—L42—— ...................................................ili—m —5:ii............................................................IIi........................................................Esi~ 3—2.00 I 41 ~ 1.26 . 0.87 0 61 0 50 两i....................................................— 172 I 40 1.31 0.88 0.62 0J3~ 由此可以看出，用H2O2处理NIH-3T3细胞而制成的细胞衰老模型是成功的。3、讨论 小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)是目前国际上公认的用于体外研究细胞复制衰老的模型，体外培养时，在经历一段快速增殖期和一定次数的群体倍增后，会进入增殖活力下降期，最后成为一个不能对生长因子作出增殖反应的衰老细胞群。过氧化氢是一种氧化剂，它作用后的细胞群与衰老对照组的细胞有相似的形态学改变，细胞体积增大、胞体变平，次级溶酶体增多，同时伴有Gl期细胞比例增加和P -半乳糖苷酶染色阳性细胞百分比增加，提示H2O2能在相对较短的时间内有效地诱导细胞衰老。本实施例研究结果显示H2O2作用3次后NIH-3T3细胞体积增大、形态不规则，胞体变平，细胞颗粒明显增加；电镜下次级溶酶体增多，线粒体肿胀，部分细胞出现异染色质增多；GI期细胞比例增加和￠-半乳糖苷酶染色阳性细胞的百分比增加。由此可见，通过H2O2诱导的细胞氧化应激损伤可以成功地建立体外细胞衰老模型。有研究表明H2O2诱导细胞衰老的机制是通过氧化应激作用使端粒长度加速缩短，从而使端粒长度更快达到一定临界长度，细胞不可逆地阻滞于Gl期，从而失去增殖活力导致衰老。 4、小结 本实验用H2O2作用3次后观察到NIH-3T3细胞体积增大、形态不规则，胞体变平，细胞颗粒明显增加；￠-半乳糖苷酶染色阳性细胞的百分比增加。因此，用H2O2可以可靠、便捷地建立体外细胞衰老模型。权利要求1.一种H2O2诱导的NIH-3T3细胞衰老模型，其制备方法为将NIH-3T3细胞接种在含10%胎牛血清的MEM，在温度37°C、饱和湿度的培养箱中培养；从20代开始，细胞随机分3组后细胞培养，3-4天换液I次，细胞达到融合时，用0. 025%胰酶后1:4传代，细胞至30代时随机收获部分细胞；将H2O2用DMEM完全培养液按不同浓度梯度稀释后，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种H2O2诱导的NIH？3T3细胞衰老模型，其制备方法为：将NIH？3T3细胞接种在含10%胎牛血清的MEM，在温度37℃、饱和湿度的培养箱中培养；从20代开始，细胞随机分3组后细胞培养，3？4天换液1次，细胞达到融合时，用0.025%胰酶后1:4传代，细胞至30代时随机收获部分细胞；将H2O2用DMEM完全培养液按不同浓度梯度稀释后，加入细胞中，形成0，300，600，1000，1500，2000μM浓度梯度，培养2小时后，弃去；用PBS或DMEM洗三遍，加入DMEM完全培养液继续培养；在连续培养到第十天，用胰酶消化6孔板中细胞，取其中5000个细胞接种到24孔板中培养24小时，用细胞衰老β？半乳糖苷酶染色试剂盒染色细胞，在高倍显微镜下观察，染上蓝色的细胞即是衰老细胞，得细胞衰老模型。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄厚才，
申请(专利权)人：江苏省中医药研究院，
类型：发明
国别省市：
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