一种依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗，由载GM-CSF壳聚糖纳米粒子和灭活的肝癌细胞混悬制成，制备方法为：将由GM-CSF、三聚磷酸钠、壳聚糖溶液组成的混合溶液，搅拌2～3h小时后收集反应液体，利用丙三醇离心，8000～12000rpm离心10～15min，离心完成后以0.9%氯化钠15～20KHz超声重悬30～45s，即可得到均匀的载GM-CSF的壳聚糖纳米粒子，测得包封率为87.08±2.32%，粒子大小为100±23.68nm；将载GM-CSF壳聚糖纳米粒子和灭活的肝癌细胞混悬制备得到依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗。疫苗制备简单、安全性强、有效性高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肝癌细胞疫苗领域,具体涉及一种依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗。
技术介绍
肿瘤免疫治疗是新兴的肿瘤治疗方法，在肿瘤综合治疗中具有较高的地位，而肿瘤疫苗是肿瘤免疫治疗的重要组成部分。肿瘤细胞疫苗在肿瘤疫苗中研究最早，应用也最为广泛，其临床应用前景及市场潜力相当之大。GVAX疫苗，即可分泌GM-CSF的灭活全肿瘤细胞疫苗，是目前应用较为广泛的肿瘤细胞疫苗。粒细胞-巨曬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colonystimulating factor, GM-CSF)是一种强烈刺激巨噬细胞和树突状细胞等抗原递呈细胞增殖、分化和成熟的细胞因子(图I)。20世纪90年代初，Dranoff及Jaffee等比较了各类细胞因子在肿瘤细胞疫苗应用中免疫活性的差异。他们利用小鼠黑色素瘤细胞系B16构建出表达并分泌不同细胞因子或趋化因子的黑色素瘤细胞疫苗，照射之后免疫荷瘤小鼠，结果发现分泌GM-CSF的肿瘤疫苗抗肿瘤活性最强。GVAX疫苗经、射线灭活后通过局部注射到达体内，分泌产生的GM-CSF可募集大量巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cells，DC)，这些抗原递呈细胞能吞噬注射局部的肿瘤细胞，在GM-CSF作用下活化、成熟、迁移，并将肿瘤细胞携带的肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原进行处理、递呈，最终诱导产生杀伤肿瘤的特异性活化T淋巴细胞。众多临床研究者在上述研究的基础上开展了临床试验，进一步表明了 GVAX疫苗在临床应用中的积极意义。早期的研究者将GM-CSF基因直接导入自体肿瘤细胞，制成能够自分泌GM-CSF的肿瘤细胞，再将这些细胞经照射处理制成细胞疫苗接种人体。一项研究结果显示，在25例非小细胞肺癌患者中，18例肿瘤患者完成接种GVAX疫苗的全部疗程并产生阳性反应，其中2例患者治疗后以无肿瘤状态生存超过2年，另3例患者分别在治疗后4、8和15个月未发现肿瘤恶化的迹象，使疾病得以控制。另一项关于前列腺癌的研究显示，55例激素治疗失败的患者接种不同剂量的GM-CSF基因转染的异基因肿瘤疫苗后，高剂量组的中位生存期和骨转移病灶进展期均明显比低剂量组长。然而有研究者称，由于肿瘤细胞的自身缺陷，GM-CSF的表达水平可受到限制，只有当肿瘤部位在数天之内维持MOng/106/24h的GM-CSF分泌浓度，机体对肿瘤才能表现出较强的免疫反应，患者的生存时间才会得到明显的延长。在白血病相关研究中，Smith等使用K562 (慢性粒细胞白血病细胞系)制备旁分泌GM-CSF的bystander细胞，实验证明这种旁分泌途径产生的GM-CSF量明显高于自体肿瘤细胞。将其与自体白血病细胞混合成新型GVAX疫苗应用于AML(急性髓细胞性白血病)自体干细胞移植后的缓解治疗54例患者参与了该项研究,有46例患者经治疗后获得了完全缓解，3年无复发生存率(relapse free survival rate, RFS)为47. 4%,总体生存期(over — all survival, OS)为57. 4% ;而在预先接受GVAX免疫的28例患者中，RFS和OS分别为61. 8%和73. 4%。、GVAX疫苗在美国对前列腺癌、肺癌、胰腺癌及白血病的研究许多已进入III期临床试验，研究结果均证实这种新型GVAX疫苗安全性比早期肿瘤疫苗效果好，不良反应液较少,如注射部位瘙痒、红斑和水肿等局部反应以及一过性流感样症状,这点和其它疫苗的不良反应类似。GVAX疫苗国内尚未开展临床应用。目前我国对生物治疗的管理尚不完善，迄今为止明确的相关规定只有1993年卫生部颁布的“人的体细胞治疗申报临床试验指导原则”，但作为新兴的治疗肿瘤的方法，而且又是具有高科技含量的新兴产业，国家相关的相关政策一直是以积极扶持为主。虽然目前GVAX肿瘤疫苗技术显现出了较好的临床应用前景，但同时也存在着一些缺陷及隐患。I)以灭活的肿瘤细胞作为GM-CSF的载体，其分泌量较不稳定，我们研究发现B78H1-GM-CSF细胞系的GM-CSF分泌量从几十至数千ng/106/24h不等，且有文献报道称当、GM-CSF超过1000ng/106/24h时反而会募集骨髓抑制性细胞抑制免疫应答，故无法对病人进行标准化应用。2) 使用肿瘤细胞携带及分泌GM-CSF，其灭活照射剂量是一个关键问题照射剂量过低，则将产生致瘤性，尤其是不能充分灭活的K562细胞将给肿瘤病人体内带入新的肿瘤细胞；照射剂量过高，则影响GM-CSF的有效分泌。最近一项临床试验中发现，以灭活K562细胞作为GM-CSF的载体，可在个别患者体内检测出少数活K562细胞。所以，其安全性存在着一定的隐患。3)以转基因技术为支撑的细胞治疗技术在我国尚未获得临床应用的许可，无法仿效国外进行临床试验研究。
技术实现思路
本专利技术针对上述问题，采用壳聚糖依赖的GM-CSF纳米缓释粒子联合灭活肝癌细胞制备新型肝癌GVAX疫苗，解决了现有GVAX肿瘤疫苗的安全性及GM-CSF分泌稳定性、时效性等问题。为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为一种依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗，由载GM-CSF壳聚糖纳米粒子和灭活的肝癌细胞混悬制成，所述载GM-CSF壳聚糖纳米粒子大小为100±23. 68nm。所述依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗的制备方法，将由GM-CSF、三聚磷酸钠、壳聚糖溶液组成的混合溶液，搅拌2 3h小时后收集反应液体，利用丙三醇离心，8000-12000 rpm离心10_15min，离心完成后以0. 9%氯化钠15_20KHz超声重悬30 45s，即可得到均匀的载GM-CSF的壳聚糖纳米粒子，粒子大小为100±23. 68nm ;将载GM-CSF壳聚糖纳米粒子和灭活的肝癌细胞混悬制备得到依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗。所述由GM-CSF、三聚磷酸钠、壳聚糖溶液组成的混合溶液是先将GM-CSF与三聚磷酸钠溶液混合后再滴加到壳聚糖溶液中，或者先将GM-CSF加入壳聚糖溶液后再滴加三聚磷酸钠溶液。所述的壳聚糖溶液是将壳聚糖溶解在0. 5 1%体积分数的乙酸溶液中，质量浓度为 I 4mg/mL。GM-CSF溶解在ddH20配置成质量浓度为120 180ug/mL的溶液、三聚磷酸钠溶解在ddH20中配置成质量浓度为0. 8 2. Omg/mL的溶液。所述三聚磷酸钠与壳聚糖的质量比为1:2 4，所述GM-CSF与壳聚糖的质量比不超过29. 80mg/g,即每克壳聚糖最多包裹29. 8mg的GM-CSF。有益效果本专利技术提供的依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗与传统技术相比具有如下优势I)、GM-CSF的分泌稳定 壳聚糖GM-CSF缓释纳米粒子能持续分泌GM-CSF>40ng/106/24h的最低有效剂量并且能控制在有效范围，不会因为分泌量的不足或者过多(>1000ng/106/24h)而减弱甚至无法发挥抗肿瘤作用。GM-CSF的分泌时限得到延长，释放浓度也更为稳定，产生的杀伤性淋巴细胞数量随之增加，免疫应答维持的时间也得到延长，不但可以有效杀伤肿瘤发生部位的肿瘤细胞，也能高效清除迁移至外周循环中的肿瘤细胞。此外，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种依赖纳米粒子包裹GM？CSF的缓释型肝癌细胞疫苗，其特征在于：由载GM？CSF壳聚糖纳米粒子和灭活的肝癌细胞混悬制成，所述载GM？CSF壳聚糖纳米粒子大小为100±23.68nm。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙倍成，陈晨，侯嘉杰，王学浩，
申请(专利权)人：孙倍成，王学浩，
类型：发明
国别省市：
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