绿色荧光蛋白转基因牛成纤维细胞株制备试剂盒制造技术

绿色荧光蛋白转基因牛成纤维细胞株制备试剂盒由外包装盒、试剂瓶和无菌装置三部分组成，属于细胞生物学技术领域。外包装盒包括盒盖，与其相连的盒体，以及盒体内左侧安放的7个试剂瓶，试剂瓶带有瓶盖。同时包括盒体内右侧放置的一个长方体的，具有独立盒盖的集细胞培养、质粒转染及筛选功能为一体的无菌装置。其布局为：上部具有1个直径200毫米、深20毫米垂直排列的细胞培养孔，中间分布4个直径5毫米、深20毫米垂直排列的锥形储液小孔，下部具有4个直径30毫米、深20毫米的细胞培养孔。本实用新型专利技术试剂盒结构紧凑、携带方便、操作简单、重复性好，省时省力，能够很好的满足科学工作需要。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及一种绿色荧光蛋白转基因牛成纤维细胞株制备试剂盒，属于细胞生物学

技术介绍
基因转染是目前生物制药、基因工程及转基因动物克隆等研究领域的重要课题。如何获得具有稳定表达外源基因的阳性克隆的细胞株具有十分重要的理论和实用价值。在获得转基因细胞株的操作技术方面，公知的对于成纤维的转染操作技术是采用脂质体等转染试剂进行，具体为将细胞接种于I个直径35毫米细胞培养皿或者6孔细胞培养板(细胞培养板的每个孔大小、形状均相同)中的一个培养孔，待12小时细胞贴壁后进行质粒转染，24-48小时后将细胞扩大培养，即传代接种于I个直径10厘米的细胞培养皿中，待细胞贴壁后采用氨基糖苷类抗生素G418进行药物筛选,每2天更换I次氨基糖苷类抗生素G418,持 续筛选14天左右，才能够获得具有稳定表达外源基因的细胞株。因此公知的这种转染技术存在操作过程繁琐、时间长、成本高、不利因素多、重复性差的缺点。故专利技术一种能够省时省力、稳定的、以较低成本获得能够稳定表达绿色荧光蛋白的转基因牛成纤维细胞株的试剂盒是必要的。
技术实现思路
为了克服公知转染技术存在的缺点，本技术的目的在于提供一种能够省时省力、稳定的、以较低成本获得能够稳定表达绿色荧光蛋白的转基因牛成纤维细胞株的试剂盒。本试剂盒是将细胞培养、转染及筛选所需的试剂集中在一起，方便操作，不需现用现配。同时将细胞培养、转染及筛选所需的培养器具集于一体，使其结构紧凑、便于携带且操作简便，避免了操作时反复拾取不同器具的繁琐、降低了无菌操作时细胞污染的风险，使其很好的适用于科研领域的研究需要。本技术通过以下技术方案实现本技术提供一种制备能够稳定表达绿色荧光蛋白的转基因牛成纤维细胞株的试剂盒。试剂盒由外包装盒、试剂瓶和无菌装置三部分组成。外包装盒为厚度为2毫米的普通塑料材质，整体为长方体形状，是由盒盖和盒体组成。盒盖在一长边与盒体直接相连，侧盒盖则用于加强固定泡沫在盒内的稳定性。盒盖另一长边中央有一锁扣，该锁扣可将盒盖紧扣与盒体上。该锁扣整体为长方形，材质优选铁片，由锁与扣组成。锁为一丁字形，由固件基座和可转动固件头组成。固件基座可用铆钉固定于盒体上。固件头为丁字形，其下端为膨大球形，与固件基座柄的球形窝形成球窝连接，使固件头可在基座上转动。固件头上端为方形长条，该方形长条直径略小于扣中央的长方形扣孔。扣的底边成合页状能在固定于盒盖上的铆钉固定的固定体上自由转动；扣中央为一长方形扣孔。当盒盖盖在盒体上时，锁的固件头上端的方形长条即可穿过扣中央的长方形扣孔。因方形长条可转动，故此时若拧动方形长条，即可将盒盖紧盖于盒体之上。试剂瓶优选7个，置于盒体内左侧相应的泡沫内的瓶槽中。泡沫整体大小为盒体内体积的3/5，其上有7个瓶槽，优选瓶槽的安防方式为前面I个，后面2排各3个。试剂瓶由瓶体和瓶盖组成,试剂瓶体为玻璃材质,瓶盖为塑料材质,试剂瓶体的外形可以为圆柱形、棱柱形或其他形状，优选圆柱形。试剂瓶内试剂均为独立容器包装，所装溶液均经过O. 22微米微孔滤膜的无菌过滤处理。7瓶试剂分别盛装a.线性化处理后的IRES-EGFP质粒(绿色荧光蛋白基因的质粒表达载体)，质粒浓度为I微克/微升，采用这种限制性内切酶提前对绿色荧光蛋白的表达载体IRES-EGFP进行酶切处理，使其成为线性化的载体片段，从而能够通过转染，更好地整合到牛成纤维细胞的基因组中，提高绿色荧光蛋白稳定表达的效率；b. PEI (聚乙烯亚胺)转染试剂，该试剂排除了细胞培养中使用血清对转染效率的影响，且该试剂转染效率高、成本低、重复性好，能够很好的适用于牛成纤维细胞的转染研究；c. DMEM培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基)，为质粒和转染试剂的孵育溶液；d.牛成纤 维细胞生长所需培养液(按体积百分数于90毫升DMEM培养基中添加10毫升标准胎牛血清)；e.真核细胞筛选用氨基糖苷类抗生素G418，浓度为400-500微克/毫升；f. PBS磷酸盐缓冲液；g.细胞传代所需消化液O. 25%胰蛋白酶，即按质量百分数于100毫升D-hanks液体(无钙镁离子的平衡盐缓冲液，PH8. O)中添加O. 25克胰蛋白酶。以上所述7瓶试剂需要在4°C条件下保存，以确保试剂活性。无菌装置由无菌塑料袋、独立盒盖、细胞培养板组成。无菌塑料袋相对于整个试剂盒为独立包装，在无菌装置的最外面，在灭菌后可用塑封机密封。独立盒盖长方形，四边皆向同一方向突出一段，其内面大小等同于细胞培养板，使之可正好紧扣于细胞培养板之上，用时可直接从细胞培养板上拿下来。细胞培养板长方形，其材质为光学透明纯聚苯乙烯，该材质能够促进细胞贴壁及生长。细胞培养板上有9个孔，分别是上部的I个直径200毫米、深20毫米的圆柱形细胞培养大孔，中间的4个上口直径5毫米、深20毫米垂直排列的锥形储液小孔，下部的4个直径30毫米、深20毫米的圆柱形细胞培养小孔。该无菌装置可执行细胞培养、质粒转染及筛选功能。本技术有益效果为本技术改变了以往在获得转基因细胞株时对于细胞培养及筛选时培养孔面积的选择，即本技术选用直径30毫米的细胞培养孔进行细胞培养，在扩大培养时将培养孔直径由原来的100毫米增加至200毫米，从而使细胞在传代之后更加均匀分散，通过氨基糖苷类抗生素G418的药物筛选，实验证明在7天左右的时间即可筛选得到具有能够稳定表达绿色荧光蛋白的牛成纤维细胞转基因细胞株，大大缩短了时间，节省了人工，降低了成本。附图说明以下通过附图和具体实施方式对本技术作进一步的详细说明。图I绿色荧光蛋白转基因牛成纤维细胞株制备试剂盒盒盖打开时整体结构示意图。图2绿色荧光蛋白转基因牛成纤维细胞株制备试剂盒试剂瓶的立体结构示意图。图3绿色荧光蛋白转基因牛成纤维细胞株制备试剂盒的无菌装置结构示意图。图中，I.细胞培养板，2.细胞培养大孔，3.锥形储液小孔，4.细胞培养小孔，5.试剂瓶盖，6试剂瓶，7.固定泡沫，8.扣，9.锁，10.试剂盒外包装盒体，11.试剂盒外包装侧盒盖,12.试剂盒外包装盒盖,13.扣孔,14.转动合页，15.扣铆钉，16.可动固件头，17.固件基座，18.锁铆钉，19.无菌装置的盒盖，20.无菌塑料袋。具体实施方式绿色荧光蛋白转基因牛成纤维细胞株制备试剂盒由外包装盒、试剂瓶和无菌装置三部分组成。外包装盒为厚度为2毫米的普通塑料材质，整体为长方体形状，是由盒盖12、侧盒盖11和盒体10组成。盒盖12在一长边与盒体10直接相连，侧盒盖11则用于加强固定泡沫7在盒内的稳定性。盒盖12另一长边中央有一锁扣，该锁扣可将盒盖紧扣与盒体上。该锁扣整体为长方形，材质优选铁片，由锁9与扣8组成。锁9为一丁字形，由固件基座17和可转动固件头16组成。固件基座17可用锁铆钉18固定于盒体10上。可转动固件头16为丁字形，其下端为膨大球形，与固件基座柄的球形窝形成球窝连接，使可转动固件头16可在固件基座17上转动。固件头16上端为方形长条，该方形长条直径略小于扣中央的长方形扣孔13。扣8的底边有合页14，能在固定于盒盖上的扣铆钉15固定的固定体上自由转动；扣中央为一长方形扣孔13。当盒盖盖在盒体上时，锁的固件头上端的方形长 条即可穿过扣中央的长方形扣孔13。因方形长条可转本文档来自技高网...

【技术保护点】
绿色荧光蛋白转基因牛成纤维细胞株制备试剂盒由外包装盒、试剂瓶和无菌装置三部分组成，其特征在于：外包装盒为厚度为2毫米的普通塑料材质，整体为长方体形状，是由盒盖(12)、侧盒盖(11)和盒体(10)组成；试剂瓶优选7个，置于盒体内左侧相应的泡沫内的瓶槽中，泡沫整体大小为盒体内体积的3/5，其上有7个瓶槽，优选瓶槽的安放方式为前面1个，后面2排各3个；无菌装置由无菌塑料袋、独立盒盖、细胞培养板组成，细胞培养板(1)上有9个孔，分别是上部的1个直径200毫米、深20毫米的圆柱形细胞培养大孔(2)，中间的4个上口直径5毫米、深20毫米垂直排列的锥形储液小孔(3)，下部的4个直径30毫米、深20毫米的圆柱形细胞培养小孔(4)。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：佟慧丽，周佳勃，岳顺利，李树峰，严云勤，金鑫，李光鹏，金慧然，宋任举，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：实用新型
国别省市：