癌症和高度增生的自动检测方法技术

检测生物样品中癌症和相关增生的自动方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术背景相关申请交叉引用本PCT申请要求2009年3月10日提交的，申请号为12/400，975的美国专利申请的优先权，该美国专利申请是2007年10月26日提交的，申请号为11/925，123的美国专利申请的部分继续申请，所述11/925，123为2007年10月25日提交的，申请号为11/924，293的美国专利申请的继续申请，所述11/924，293要求2006年10月25日提交的，申请号为60/862, 974的美国临时申请优先权。该参考文献和所有在本说明书中引用的其他参考文献，以及它们的参考文献在适合用于教导额外的或备选的细节、特征和/或技术背景的情况下均通过弓I用的方式并入本文。 专利
本专利技术一般涉及用于检测受试者中癌症和发育异常，尤其是高度发育异常的自动方法。一方面，提供用于监测一种或更多种癌症治疗方案有效性的方法。相关技术的描述许多方法已知有助于样本的显微分析。例如，非限制地，已知某些染料对某些细胞或亚细胞结构具有亲和力。因此所述染料通过辅助进一步显示所述结构，可用于辅助分析。染料与所述结构的结合可以使用多种显微检测技术鉴定和分析。细胞和组织的荧光显微术为本领域所熟知。已开发出在显微镜中使荧光细胞成像和提取所述细胞中发生的空间分布和时间变化相关信息的方法。一些上述方法及其应用由Taylor等在American Scientist 80 (1992),第322-335页的文章中有所描述。这些方法经过设计和优化，用于制备一些标本，用于细胞中荧光报告分子的分布、含量和生化环境的高时空分辨率成像测量。可采取落射荧光显微镜检测荧光信号，其使用发射的荧光形成图像(而常规反射显微镜使用散射的照明光形成图像)。落射荧光显微镜的激发光用于激发样本中的荧光标签，使其发射荧光。落射荧光显微镜的优点在于，制备好的样本中，荧光分子优先附着在感兴趣的生物结构上，使该感兴趣的生物结构得以鉴别。生物样本的自动显微分析方法改进了诊断程序，优化了基于显微镜的诊断设备中的样本通量。以下更全面描述的多个共同拥有的美国专利申请公开了用于自动显微分析的设备和方法的方面和实施方案，包括整合的机器人显微镜系统，动态自动显微操作和载玻片扫描系统，多种可互换的物镜，滤镜和适于在自动显微镜系统中使用的类似元件，适于在自动显微镜系统中使用的自动显微镜载物台，适于在自动显微镜系统中使用的自动显微镜载玻片盒和载玻片操作系统，适于在自动显微镜系统中使用的自动显微镜载玻片装载和卸载机构，应用电脑内置程序驱动对生物样本中的荧光信号进行显微检测的自动化方法，其可用于驱动自动显微镜的系统，使用电脑内置程序以驱动显微镜进行用于图像处理的FISH分析的显微镜自动化操作。缩写词“FISH”(荧光原位杂交)指使用在被例如紫外或可见光源照射时发出特征性光或颜色的荧光标签或标记以检测染色体结构的技术。FISH使用只与与其具有高度序列相似性的染色体的那些部分结合的荧光探针，所述探针可针对特异性染色体和特异性染色体区域，必须具有足够长度以与其靶标(不与基因组中相似的序列)特异性杂交，但是不能太大而阻碍杂交过程，并且应该用荧光团直接标记。标记可以采用多种方式，例如，缺口平移和使用标记核苷酸的PCR。如果需要增强信号而超过显微镜的检测阈值(其取决于许多因素，例如探针标记效率、探针和荧光染料的种类)，可以使用以例如生物素或地高辛等半抗原标记的探针，特异性荧光标记的抗体或链霉亲和素与所述半抗原分子结合，从而使荧光增强。FISH技术可用于鉴定染色体异常和基因定位。癌细胞中基因过表达的通常研究机制一般称为基因扩增，这是一个基因在祖细胞染色体内复制成多拷贝的过程。该过程包括含有所述基因的染色体区域无计划性的复制，随后复制片段重组返回所述染色体(Alitalo K.等.(1986), Adv. Cancer Res. 47 235-281)，结果会产生50个或更多的基因拷贝。重复区域有时称为“扩增子”，转化细胞中的基因表达水平(即产生的信使RNA量)以与产生的基因拷贝数量同样的比率升高(Alitalo 等)。与其它致癌基因，尤其是那些成神经细胞瘤致癌基因相关的工作表明，原癌基因的基因重复与更恶性癌症形式相关的事件，并可作为临床结果的预示(Schwab M.等的综述(1990), Genes Chromosomes Cancer I : 181-193 ;Alitalo 等)。在乳腺癌中，已有报告erbB2基因的重复与疾病复发和存活时间减低均相关(Slamon D. J.等.(1987)，Science235 =178-182)。有证据表明，erbB2有助于鉴别对使用环磷酰胺、阿霉素和氟尿嘧啶的辅助化疗有反应的肿瘤(Muss 等.N Engl J Med. 1994 330(18) :1260-6)。在乳腺癌中发生基因重复的基因中仅有一部分被鉴定出来。首先，染色体异常，例如双微(DM)染色体和均匀染色区(HSR)在癌细胞中大量存在。HSR是在染色体组型分析中全长显现中等密度吉姆萨染色，而非常规的明暗交替带纹的模式，它们对应于多基因重复。HSR在乳腺癌中尤其丰富，在所调查的肿瘤中最高达60-65%都有出现(DutrillauxB.等 (1990), Cancer Genet Cytogenet 49 :203-217 ；Zafrani B.等 (1992), HumPathol23 :542-547)。当使用任意16个已知人致癌基因(包括erbB2和myc)的探针，通过原位杂交检测所述区域时，仅有一部分肿瘤显示了与HSR区域的任意杂交。而且，每个染色体组型中只有一部分HSR被牵涉。第二，比较基因组杂交(CGH)已经揭示肿瘤中拷贝数量的增加的存在，即使是在HSR外的染色体区域。CGH是一种新方法，其中使用两种不同荧光染料对具有来自正常细胞和癌细胞的DNA片段的全长伸展染色体进行同时染色。图像经电脑处理，计算荧光比率，表明癌细胞中发生扩增或缺失的染色体区域(Kallioniemi A.等.(1992), Science 258 818-821)。该方法最近被用于15种乳腺癌细胞系(Kallioniemi A.等.(1994)，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 91 :2156-2160)，在所有23对染色体中均检测到DNA序列拷贝数量的增加。So, C-K 等(Clinical Cancer Research 10 19-27, 2004)发现在来自中国林州(林县)的食管鳞状细胞癌样本中，环AMP反应元件结合蛋白(CBP)，一种核转录辅激活蛋白，发生内部串联重复。So等表不，CBP基因的内部串联重复在人鱗状细胞癌中是频发的遗传事件。人表皮生长因子受体2(HER-2)/neu(c-erbB_2)基因定位于染色体17q，编码作为表皮生长因子受体(EGFR)或HER家族成员的跨膜酪氨酸激酶受体蛋白质(Ross，JS等，TheOncologist.第8卷第4期，307-325，2003年8月)。HER-2基因在一部分，可能人乳腺癌的25%中发生扩增。荧光原位杂交(FISH)常用于检测染色体异常，包括序列改变，例如在致癌基因中发现的单核苷酸多态性或突变。已经公开本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.03.10 US 12/400,975书限定的本发明的精神和范围下，可对本发明进行多种变化和/或修改。本文引用的所有文件，在适合用于教导额外的或备选的细节、特征和/或技术背景的情况下均通过引用的方式并入本文。权利要求1.一种筛查受试者中病变的存在和/或程度的方法，所述病变特征在于受试者细胞中的异常染色体成分，所述方法包括以下步骤 a)使来自所述受试者的包含细胞核的生物样本与针对至少一种表现异常特征的染色体序列的一种或更多种可区分的标记探针接触，所述接触在促进所述一种或更多种探针与所述至少一种序列杂交的条件下进行； b)自动获得所述一种或更多种与染色体序列杂交的可区分的标记的表现； c)自动分析所述表现中一种或更多种标记结合的分布和强度，以确定异常染色体成分的存在和/或程度；和 d)自动报告步骤c)的分析结果； 其中步骤b)_d)在无人干预下实施。2.根据权利要求I所述的方法，其中，步骤b)-d)由自动显微镜系统实施。3.根据权利要求I所述的方法，其中，探针靶向单核苷酸多态性(SNP)，突变单或多碱基核苷酸序列，TERC和PIK3A基因座附近800kb染色体区域内重复或扩增的基因或其部分，3号染色体着丝粒，7号染色体着丝粒，以及包含TERC、PIK3A基因、基因或这些基因的部分的5'和3'附近区域的序列中的至少一种。4.根据权利要求I所述的方法，其进一步包括在所述杂交条件下将所述样本与针对已知不是异常的染色体基因座的标记参照探针接触，或将所述样本与参照染色剂接触，并使获得表现和分析步骤以参照探针或染色剂为参照。5.筛查受试者中与癌症、高度增生或高度发育异常相关异常的方法，其包括以下步骤 a)从受试者中获得包含细胞核的生物样本； b)在促进探针与靶向的染色体基因座杂交的条件下，使生物样本与第一探针接触，该第一探针具有针对异常相关的染色体序列的第一可检测标记； c)在所述杂交条件下，使所述样本与至少一种针对已知不是异常的染色体基因座的可检测地标记的参照探针接触，并进一步将所述样本与细胞核参照染色剂接触； d)在样本中自动寻找具有所述参照染色剂的区域，并对与染色体序列结合的标记成像； e)自动分析所述标记图像中杂交标记的分布和强度；和 f)自动报告步骤e)的分析结果； 其中步骤d)_f)在无人干预下实施。6.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤d)-f)由自动显微镜执行。7.根据权利要求5所述的方法，其中，在接触步骤之前，所述细胞核从样本中分离并沉积形成层。8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述样本包括活组织检查样本、手术切除样本、血液、淋巴、尿液、渗出液、生物流体、上皮碎屑、子宫颈涂片、口腔粘膜涂片、灌洗液、抽吸液、唾液、痰和组织中的一种或更多种。9.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第一和第二标记是荧光标记。10.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第一探针靶向单核苷酸多态性(SNP)，突变序列，重复或扩增的基因或其部分，3号染色体着丝粒，7号染色体着丝粒，以及包含T...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·塔法斯，P·齐普拉斯，M·基尔佩崔克，G·萨基斯，
申请(专利权)人：伊康尼西斯公司，
类型：发明
国别省市：