本发明专利技术公开了一种中国番茄黄曲叶病毒卫星的组成型表达启动子。该启动子来自于中国番茄黄曲叶病毒相伴随的beta卫星分子。分离的启动子是该beta卫星分子的βC1ORF的部分缺失启动子、全长启动子及串联启动子序列。实验表明来自于中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的βC1ORF的启动子为组成型表达的启动子。本发明专利技术涉及了中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的βC1ORF的缺失启动子、全长启动子和串联启动子序列以及含有该βC1ORF缺失启动子、全长启动子和串联启动子序列的表达盒。本发明专利技术中的启动子可应用于植物抗病毒基因工程及植物转基因工程。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种中国番茄黄曲叶病毒卫星的组成型表达启动子。具体地说，本专利技术涉及中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的PClORF缺失启动子、全长启动子和串联启动子序列的分离。本专利技术也涉及含有连接异源基因的中国番茄黄曲叶病毒beta卫星的β ClORF缺失启动子、全长启动子和串联启动子的载体盒的构建。另外，本专利技术也涉及利用含有中国番茄黄曲叶病毒beta卫星的β ClORF各种 启动子的表达载体进行瞬间表达和稳定表达的方法。
技术介绍
植物基因工程的目的是将外源基因导入受体植物后使其正确而有效地表达，而启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。人们可根据需要选择或人工构建合适的启动子来研究新基因的功能，阐明生物体的生长发育及其他生命周期的过程与机理，目前已有许多不同来源的启动子被用于植物品质改良基因工程、抗病育种基因工程以及植物生物反应器等基因工程领域。这些启动子中一大类是从根瘤农杆菌中分离出来，另一大类为植物本身来源的启动子。相比上述启动子控制的目标基因表达量往往较低，或者与受体植物细胞基因组序列具有一定的同源性的劣势，植物病毒启动子在植物遗传转化中有着不可或缺的优势。已经鉴定的植物病毒启动子，主要包括组成型表达启动子和组织特异性表达启动子。组成型启动子能够驱动外源基因在植物不同组织或器官以及不同的发育阶段持续和稳定的表达，不表现时空特异性，也不受外界因素的诱导。其中花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子在双子叶植物基因表达中被广泛应用，它具有多种顺式作用元件，利用CaMV 35S核心启动子与CaMV 35S启动子的5’端不同区段和烟草花叶病毒(TMV)的5’非转录区(omega序列)相连，发现该启动子可驱动报告基因在双子叶植物烟草和单子叶植物水稻中均高效表达。有研究表明利用CaMV 35S启动子的串联重复序列作为启动子元件能较大幅度地提高启动子活性，而进ー步的研究表明启动子元件或片段的重复虽然能够提高其表达活性，但启动子的表达模式不会改变。因此，通过对启动子进行改造有可能提闻启动子驱动外源基因表达的能力，从而为外源基因闻效表达载体的构建及应用打下良好基础。双生病毒是世界范围内广泛存在的ー类具有孪生颗粒形态的植物单链DNA病毒。beta卫星是与某些单组份双生病毒相伴随的ー类分子，该分子大小约1.3 kb,是其辅助病毒基因组的一半左右。beta卫星分子依赖于其辅助病毒进行DNA复制、移动和包裏。其基因组中除了存在一个富含腺嘌呤的区域(A-rich region)和一个卫星保守区(SCR)タト,还存在ー个大小、位置和氨基酸序列上高度保守的β C10RF，现已证实其与致病性紧密相关，它的缺失并不影响beta卫星的复制，并且已有实验表明beta卫星可以作为病毒诱导的基因沉默载体进行遗传操作。已鉴定来源于中国番茄黄曲叶病毒YlO分离物相伴随的beta卫星分子的启动子为韧皮部特异性表达的启动子，而本研究中来源于中国番茄黄曲叶病毒Y25分离物相伴随的beta卫星分子和上述beta卫星分子同源性达78. 7%，属于同一卫星分子的不同分离物，但是两者在致病表型上却有比较大的差异，推测该beta卫星的启动子在表达类型上也有别于上述beta卫星的启动子，有可能为植物基因表达提供ー些有价值的表达元件，并为两类beta卫星分子不同致病性机理的研究打下良好的分子生物学方面的基础。因此，本专利技术的开展既可以通过了解决定致病相关蛋白PCl的启动子的活性，有助于了解双生病毒致病性和侵染的机理，并且可以为不同目的的植物基因工程提供合适类型的启动子，为植物基因工程的迅速做出一定贡献。已知PClORF启动子是影响病毒卫星载体表达效率的重要因素，而该启动子的表达类型也决定了其在植物遗传转化中的应用价值，本专利技术分析了中国番茄黄曲叶病毒Υ25分离物相伴随的beta卫星分子中β ClORF的缺失启动子、全长启动子和串联启动子的表达活性以及全长启动子的表达类型。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供ー种中国番茄黄曲叶病毒卫星的组成型表达启动子。 中国番爺黄曲叶病毒卫星的组成型表达启动子所述启动子DNA序列为中国番爺黄曲叶病毒beta卫星分子的PClORF的缺失启动子SEQ ID NO: I、全长启动子SEQ ID NO:2或串联启动子SEQ ID NO:3所示DNA序列。DNA构建体包括权利要求I所示的中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的β ClORF的缺失启动子SEQ ID NO: I、全长启动子SEQ ID NO:2或串联启动子SEQ ID NO:3，以及与之进行可操作连接的有效基因，其中所述有效基因包括杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因。利用植物细胞表达杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因的方法包括如下步骤(a)以可表达的方式将杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因连接到中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的PClORF的缺失启动子SEQ IDNO: I、全长启动子SEQ ID NO:2或串联启动子SEQ ID NO:3所述的启动子DNA序列下游以获得重组DNA片段；(b)将该重组DNA片段插入植物表达载体中；(c)用上述重组表达载体转化植物细胞；(d)培养该植物细胞表达杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因。利用植物细胞制备蛋白质的方法包括如下步骤(a)以可表达的方式将编码所需蛋白质的DNA连接到中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的PClORF的缺失启动子SEQ ID NO: I、全长启动子SEQ ID NO:2或串联启动子SEQID NO: 3所述的启动子DNA序列下游，获得重组DNA片段；(b)将重组DNA片段插入表达载体中，获得重组表达载体；(C)重组表达载体经农杆菌或基因枪法转化植物细胞，培养转化的植物细胞以表达所需的蛋白质；(d)从培养物中回收所需的蛋白质。表达载体含有中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的β ClORF的缺失启动子SEQID NO: I、全长启动子SEQ ID NO: 2或串联启动子SEQ ID NO: 3所述的启动子DNA序列，其中所述载体是适用于植物细胞的质粒载体、噬菌体或病毒，所述载体能够插入杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因。本专利技术与现有技术相比具有的有益效果I)应用本专利技术中的启动子，在植物抗病基因工程中可以实现有效的抗病目的。组成型启动子与组织特异性启动子相比，它能持续高效地表达目的基因，能有效控制病虫害在整个植株中蔓延，使植物各类组织细胞都得到保护。组织化学染色法结果表明，本专利技术中的全长启动子在转基因植株根、茎、叶的皮层细胞、叶肉细胞以及维管组织的韧皮部、木质部中都能够表达(如图5)。组成型表达的强启动子，通常会导致外源基因在植株体内的过量表达，从而对植株生长发育产生负面影响。尽管本专利技术中中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的串联启动子活性明显强于全长启动子以及缺失启动子的活性，但与强组成型表达启动子CaMV 35S启动子相比，串联启动子的活性仅是它的58. 62%，所以该启动子驱动的外源 基因的表达量对植株生长发育产生的影响较小。鉴于本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种中国番茄黄曲叶病毒卫星的组成型表达启动子，其特征在于：所述启动子DNA序列为中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的βC1？ORF的缺失启动子SEQ？ID？NO:？1、全长启动子SEQ？ID？NO:？2或串联启动子SEQ？ID？NO:？3所示DNA序列。
【技术特征摘要】
1.ー种中国番茄黄曲叶病毒卫星的组成型表达启动子，其特征在于所述启动子DNA序列为中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的PCI ORF的缺失启动子SEQ ID NO: I、全长启动子SEQ ID NO: 2或串联启动子SEQ ID NO: 3所示DNA序列。2.—种DNA构建体，其特征在于包括权利要求I所示的中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的PCI ORF的缺失启动子SEQ ID NO: I、全长启动子SEQ ID NO: 2或串联启动子SEQ ID NO: 3，以及与之进行可操作连接的有效基因，其中所述有效基因包括杀虫剂基因、除3.ー种利用植物细胞表达杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因的方法，其特征在于包括如下步骤 (a)以可表达的方式将杀虫剂基因、除草剂抗性基因、抗真菌基因、抗细菌基因或抗病毒基因连接到中国番茄黄曲叶病毒beta卫星分子的PCI ORF的缺失启动子SEQ ID NO:I、全长启动子SEQ ID NO: 2或串联启动子SEQ ID NO: 3所述的启动子DNA序列下游以获 得重组DNA片段； (b)将该重组DNA片段插入植物表达载...
【专利技术属性】
技术研发人员：钱亚娟，张洁，周雪平，吴建祥，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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