本发明专利技术公开了一种多重巢式甲基化特异性PCR扩增引物，包括核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1～42所示的引物。所述多重巢式甲基化特异性PCR扩增引物的使用方法，步骤如下：（1）取患者血清提取DNA；（2）取DNA溶液，进行甲基化修饰；（3）采用引物配合PCR工作液进行检测；（4）结果判断：取所得产物，琼脂糖凝胶电泳，凝胶放置凝胶成像系统进行拍照分析，肉眼判断反应结果。本发明专利技术的多重巢式甲基化特异性PCR（MN-MSP）检测技术，最大限度地克服了血清游离DNA微量及单一甲基化标记物敏感性、特异性不高的缺点，实现了对7个目的基因甲基化状态的高效检测，具有特异性强、准确性高等优点，可作为一种有效的早期卵巢癌诊断检测手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种多重巢式甲基化特异性PCR (MN-MSP)扩增引物及其使用方法，以及在检测卵巢癌，特别是早期卵巢癌中的应用。
技术介绍
目前，卵巢癌发病率位居女性生殖系统恶性肿瘤第三位，病死率居第一位，占所有因癌症死亡女性患者3%。卵巢癌90%以上为上皮性卵巢癌，发病隐匿，临床确诊时约80%患者疾病已为晚期，预后差。晚期卵巢癌(FIGO II -IV期)患者5年生存率仅为30 45%，而早期卵巢癌(FIG0 I期)患者5年生存率高达90%以上。因此，除积极寻找新的有效的治疗方式外，探讨卵巢癌发生发展的生物学机制，研发新型卵巢癌早期诊断技术迫在眉睫。现有技术中尚无简便有效的、精确的、可常规用于卵巢癌早期诊断的检测方法。CA125是目前普遍使用的卵巢癌标志物，但仅有50 60%的I期卵巢癌患者CA125水平升高，且其他疾病如卵巢子宫内膜异位囊肿等亦可引起CA125水平升高，故其敏感性和特异性较差，卵巢癌阳性预测值仅有109^35%。总体而言，对于血清CA125检测、经阴道超声探查等传统的早期诊断方法单一或联合应用，目前均无证据显示可降低人群的卵巢癌发病率和(或)病死率。其主要原因在于这些方法的假阴性或假阳性率均过高，敏感性和特异性达不到临床需要。DNA甲基化即未甲基化胞卩密唳-憐酸-鸟嘌呤(Cytosine-phosphate-Guanosine，CpG) 二核苷酸发生甲基化，是重要的表观遗传学机制，是肿瘤抑制基因失活的关键机制之一，在某些情况下可能是唯一的机制。目前研究已证实原发性卵巢癌可有多种抑癌基因的甲基化，提示卵巢癌显示出CpG岛甲基化表型。作为癌症发生的早期事件，抑癌基因DNA异常甲基化检测可以在患者出现临床表现或者影像学证据之前做到分子诊断，为卵巢癌的早期诊断提供了新的途径。目前，研究已证实癌症患者血清富含肿瘤DNA (Serum free circulating DNA,SfcDNA)，可用于癌症分子生物学诊断。使用体液标本(血清、尿液等)检测其中游离肿瘤特异DNA在其他癌症如肺癌、头颈部肿瘤、前列腺癌等已被证实可行。更为重要的是，肿瘤游离DNA不仅在晚期转移癌症患者血清内存在，对于早期患者，血清内同样可检测到肿瘤游离DNA，研究认为其来源于侵入体内循环但无浸润机体实质器官能力的肿瘤细胞，或是由凋亡肿瘤细胞释放进入体内循环。因此，利用血清游离DNA (SfcDNA)进行癌症的早期分子生物学诊断是当前研究的一大热点。虽然国内外研究者利用卵巢癌患者血清游离DNA甲基化检测，在卵巢癌早期诊断中的研究取得了令人振奋的进步，但是在实际操作过程中存在以下局限性1、血清游离DNA微量(正常人浓度平均为0. 03ug/ml，肿瘤患者浓度平均为0. 18ug/ml )，并且多以小片段形式存在，大大增加了提取的难度，降低了临床检测的敏感性和特异性；2、目前DNA甲基化的主要研究方法为甲基化特异性PCR (Methylation Specific PCR，MSP)，其操作繁琐，DNA经亚硫酸氢盐修饰后丢失严重，一般只用于单个基因检测，特异性和敏感性均较低；3、卵巢癌抑癌基因失活的不确定性及血清游离DNA的局限性，导致单一卵巢癌甲基化标记物检测无法满足临床要求。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种多重巢式甲基化特异性PCR (MN-MSP)扩增引物及其使用方法，以及其在检测卵巢癌，特别是早期卵巢癌中的应用。本专利技术的多重巢式甲基化特异性PCR (MN-MSP)检测技术，在国内外首次将多重PCR (Multiplex PCR)、巢式PCR (Nested PCR)与甲基化特异性PCR (MSP)相结合，利用课题组开发的引物设计软件设计全新的PCR引物，并模拟整个PCR过程，避免PCR过程中引物二聚体、发卡结构等的形成，同时创新性的应用两步爬坡缓慢退火(Ramping anneal)的方法,保证引物与模板结合的特异性，最大限度地克服了血清游离DNA微量及单一甲基化标记物敏感性、特异性不高的缺点，可实现最低达l/8000ug DNA (约相当于19个基因组DNA)中7个目的基因甲基化状态 的高效检测，并经临床标本反复验证，对现有检测技术提供了有力补充，成为一种有效的早期卵巢癌诊断检测手段。 本专利技术是通过以下技术方案实现的一种多重巢式甲基化特异性PCR扩增引物，包括针对7种目的基因APC，RASSF1A,CDHl, RUNX3, TFPI2, SFRP5和OPCML的引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I 42所示，如表I所示。表I.多重巢式甲基化特异性PCR (MN-MSP)检测引物(说明引物中存在简并位点(degeneration)，即Y=C/T,R=G/A)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多重巢式甲基化特异性PCR扩增引物，其特征在于：包括针对7种目的基因APC,RASSF1A,CDH1,RUNX3,TFPI2,SFRP5和OPCML的引物组，其核苷酸序列如SEQ？IDNO.1～42所示。
【技术特征摘要】
1.一种多重巢式甲基化特异性PCR扩增引物，其特征在于包括针对7种目的基因APC，RASSF1A, CDH1, RUNX3, TFPI2, SFRP5 和 OPCML 的引物组，其核苷酸序列如 SEQ IDN0. I 42所示。2.权利要求I所述的多重巢式甲基化特异性PCR扩增引物的使用方法，其特征在于步骤如下 (1)血清游离DNA的提取取患者血清，提取DNA，得DNA溶液； (2)血清游离DNA甲基化修饰取DNA溶液，进行甲...
【专利技术属性】
技术研发人员：孔北华，张青，
申请(专利权)人：山东大学齐鲁医院，
类型：发明
国别省市：
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