一种耐热中性纤维素酶Cel45及其基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体地，本发明专利技术涉及一种耐热中性纤维素酶Cel45及其基因。本发明专利技术提供了一种来源于瓶霉属Phialophora?sp.的纤维素酶Cel45，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，且本发明专利技术提供了编码上述中性纤维素酶的编码基因cel45。本发明专利技术的纤维素酶具有以下性质：最适pH7.0，最适温度60℃，良好的热稳定性，在中性和碱性范围内依然保持较高酶活。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于纺织、能源工业等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，具体地，本专利技术涉及一种耐热中性纤维素酶Cel45及其基因和应用。
技术介绍
纤维素、半纤维素和木质素等是植物细胞壁的主要组成成分。纤维素大约占细胞干重的40 45%,是由葡萄糖通过P-1,4-糖苷键连接而成的线状结构分子(Wong KK,et al. Microbiol Rev 1988，52 :305-317.)。木质素约占细胞干重的15 25%，是一种复杂酚类聚合物。纤维素的降解需要纤维素酶，纤维二糖水解酶，葡萄糖苷酶将纤维寡糖，二糖水解得到葡萄糖。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，按纤维素酶催化反应的最适pH值,可将其分为酸性纤维素酶(最适pH值为3 5)、中性纤维素酶(最适p H值为6 8)和喊性纤维素酶(最适 p H 值为 8 11) (Zhang YHP, et al. Biotechnol Adv 2006,24 452-481.)。纤维素酶有着广泛的应用，例如造纸，酿造，纺织，饲料，生物能源等领域。而同时，由于能源短缺和环境的问题，生物能源作为一种新的替代品而备受人们的关注。目前研究最多的主要为微生物来源的纤维素酶，其中真菌由于其分泌量大，且分泌到胞外而成为研究的热点。但是，不同的工业应用，对纤维素酶的性质的需求是不同的，如饲料工业需要嗜酸的纤维素酶，纺织工业需要嗜碱的纤维素酶。目前工业应用的纤维素酶，主要来自木霉属Trichoderma reesei和Penicillium spp.,这些酶的最适pH在5. 0左右,最适温度在50-60°C之间，而嗜热和热稳定性好的酶则有更好的优势耐热可以提高反应速率，降低底物的粘度，同时还可以抑制其他微生物的生长。由于不同工业对纤维素酶需求的不同，因此，获得新型具有优良特性纤维素酶的研究仍具有重大意义。克隆和分离具有中性、热稳定性好的纤维素酶可以更好的应用于生物能源、纺织等领域。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能高效应用的耐热中性纤维素酶。本专利技术的再一目的是提供编码上述耐热中性纤维素酶的基因。本专利技术的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本专利技术的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本专利技术的另一目的是提供一种制备上述耐热中性纤维素酶的基因工程方法。本专利技术的另一目的提供上述耐热中性纤维素酶的应用。本专利技术从瓶霉(Phialophora sp.)中分离得到一种新的耐热中性纤维素酶Cel45。本专利技术提供了一种纤维素酶Cel45，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。SEQ IDNO. I MQLPLPSLLGLLPFFLQASAQGSSGTGTTTRYWDCCKPSCGWPEKSNAPSPVQTRDKDDQPLNDGGNTQSGCEAGGGAFMCSDQSPWAVNETYSYGYAAVNIAGGSETSWCCACYELTFTSGPVNGKKMIVQATNTGDIGSNHFDLAIPGGGVGEFNACTDQYGAPANGWGYRYGGVHSRSDCDNFPQALKPGCDWRFDWFGGADNPSVTFKQVACPAAITAKSGCVRQNDVINEMPTGP STVPTYTP其中，该酶包括248个氨基酸和一个终止密码子，不包含信号肽，因此，成熟的纤维素酶Cel45的理论分子量为26. 2kDa本专利技术的Cel45同时具有好的热稳定性，常温下，在中性和碱性的范围内均具有高活性。本专利技术的纤维素酶，其最适pH值为7.0，在pH 5.0 10.0的范围内维持60%以上的酶活性；最适温度为60°C，在70°C和80°C具有良好的热稳定性。本专利技术提供了编码上述耐热中性纤维素酶的基因cel45。具体地，该基因的序列如SEQ ID NO. 2 所示 atgcagctccccctcccatccctcctcggactactgcccttcttcctccaagcctcggcccagggctcctccgggaccggtacgacaacgcgctactgggactgctgcaagccatcgtgcggatggccggagaagagtaatgcgccctcgccggtgcagacgcgcgacaaggatgaccagccactgaacgacggcggcaacacccagtccgggtgcgaagccggcggcggggccttcatgtgctcggaccaaagcccctgggccgtcaacgagacgtactcgtacggctatgcggcggtcaacatcgcgggcggcagcgagacgagctggtgctgcgctggctacgagctgacgtttacgagcgggccggtgaacgggaagaagatgattgttcaggctacgaatacgggtgatattgggagcaatcactttgacttggcgatccccggcggcggcgtgggcgagttcaacgcctgcaccgaccagtacggtgctccggccaacggctggggctaccggtacggcggcgtgcactcgcggtccgactgcgacaacttcccgcaggcgctcaagccgggctgcgactggcgctttgactggttcggcggcgccgacaacccatcagtgacattcaagcaggtggcctgtccagccgccatcacggccaagagcggctgtgtccgccagaacgacgtcatcaacgagatgcctactgggcccagcaccgtgccgacttacactccgtag本专利技术通过PCR的方法分离克隆了耐热中性纤维素酶基因cel45，DNA全序列分析结果表明，中性纤维素酶Cel45的结构基因cel45全长747bp。成熟蛋白理论分子量为26. 2kDa，将纤维素酶基因cel45序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对,该基因与来源于Glomerella graminicola Ml. 001的glycosyl hydrolase family 45氨基酸序列一致性为69*%。说明Cel45是一种新的纤维素酶。本专利技术还提供了包含上述耐热中性纤维素酶基因cel45的重组载体，命名为pPIC-cel45。将本专利技术的纤维素酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，优选为将本专利技术的纤维素酶基因插入到质粒PPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-cel45。本专利技术还提供了包含上述耐热中性纤维素酶基因cel45的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株GS115/cel45。本专利技术还提供了一种制备耐热中性纤维素酶Cel45的方法，包括以下步骤I)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；3)回收并纯化所表达的纤维素酶Cel45。其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/cel45。本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐热中性纤维素酶Cel45，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种耐热中性纤维素酶Cel45，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。2.一种耐热中性纤维素酶基因cel45，其特征在于，编码权利要求I所述的耐热中性纤维素酶Cel45。3.如权利要求2所述的耐热中性纤维素酶基因cel45，其特征在于，其碱基序列如SEQID NO. 2 所示。4.包含权利要求2所述耐热中性纤维素酶基因cel45的重组载体。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为载体pPIC-Cel4...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹志春，张菁，
申请(专利权)人：武汉新华扬生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：