小花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离方法。通过生物发酵法获得本菌的菌丝体和发酵液，经超声萃取，溶剂萃取后采用薄层色谱和气象色谱技术定量、定性检测苦马豆素。并通过形态学和分子生物学方法鉴定产苦马豆素内生真菌。结果显示，分离出的6株内生真菌中有一株内生真菌可产生苦马豆素，产量为16.7338mg/L。经鉴定，该菌为层出镰刀菌(Fusarium?proliferatum)。本发明专利技术与现有产苦马豆素菌种相比，其苦马豆素产量较高，生物发酵生产苦马豆素不影响草地生态环境，为解决苦马豆素来源问题，并提供菌种支持，从而为今后苦马豆素的工业化生产奠定理论基础，其发展前景广阔。
【技术实现步骤摘要】
本专利属于生物制药领域，具体涉及及所得产苦马豆素菌株。
技术介绍
苦马豆素属多羟基吲哚里西啶类生物碱，是一种极强的a -甘露糖苷酶竞争性抑制剂，导致糖蛋白合成异常及部分合成的低聚糖在 溶酶体内聚积，引起细胞空泡变性，造成器官组织损害和功能障碍而中毒。但苦马豆素有增强机体免疫功能、抗病毒、抗癌抗肿瘤、抗菌等药理作用。值得一提的是，苦马豆素的抗肿瘤活性已经是近年来肿瘤后备药物筛选的热点。然而制约国内苦马豆素抗肿瘤药物研发进程的主要问题是苦马豆素来源十分困难，远远不能满足人们研究的需要。内生菌是指在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的微生物。内生菌与寄主之间为互利共生关系，一方面内生菌为植物生长提供养料，促进植物生长，另一方面使得宿主植物对环境表现适应性，对环境胁迫表现出一定的抗性(如抗干旱、抗病虫害等)，有的还对食草动物表现出毒性，以维持其生存的需要。目前苦马豆素的来源有三种途径，第一种是从豆科黄芪属、棘豆属植物和苦马豆属植物，以及旋花科番薯属、锦葵科黄花稔属植物中提取。由于植物本身含苦马豆素的量很低，提取率低，产量有限，难以满足需求；第二种是通过人工合成途径得到，合成产物存在同分异构和手性结构现象，使得分离很困难，产率低，并不适宜大规模的工业化生产；第三种方法是从真菌菌丝体或发酵液中提取即生物合成。在目前获取苦马豆素的三种途径中，人工合成途径是人们研究的重点。自美国化学家Yasuda(1984)、Bennett (1989)等先后报道人工合成苦马豆素以来，人们采用了不同的方法合成苦马豆素，可分为以下四种①MOOtOO(2001)的合成方法，关键步骤是使用氨水使二乙醒酮(keto-bisaldehyde)的氨基化降低了 3倍，以保证目标物质只有一种对映异构体。该法以2，3，5，6_ 二-0-甘露呋喃糖(2，3 :5，6-di-0-mannofuranose)为起始物，共需13步，产率为15%。②Trost (1999)和Katsuki (2000)报道的不对称合成法，以二元醇为起始物，分别需要17步和11步，产率为13%和10%。③Pearson (2002)报道的改进后的方法。以异抗坏血酸(D-isoascorbic acid)为起点，共需10步，产率为12 %。④Blechert (2002), Carretero (2000), Pyne (2002)等报道的以卩引哚里西唳顺二轻基亮氨酸(syn-dihydroxylation)衍生物开始，分别需要15步，18步和16步，产率分别为38%(以内消旋二元醇开始计算)，6. 5%和4.5%。中国科学院院士周维善等(1993)人工合成苦马豆素也获成功，但产率很低。从植物(主要是疯草)中分离是目前提取苦马豆素所常用的方法，但这种方法有很大的局限性，对草原植被造成破坏，且疯草中苦马豆素含量较低，不能作为大规模提取苦马豆素的方法。前两种方法(从植物中提取和化学合成)，由于产量低，不能满足人们对苦马豆素抗肿瘤活性研究及其产品开发的需要。因此，探索通过产量高、提取成本低且对环境没有危害的微生物发酵途径获取苦马豆素，就成为目前人们关注的热点。这就是第三种方法从真菌菌丝体或发酵液中提取即生物合成。关于苦马豆素的生物合成，目前国内已经申请的专利有6项即“生物发酵提纯苦马豆素的工艺”(02114591. I)、“绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺”(200610043120. 5)、“白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺”(200710199249. X)、“一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌及其制备方法和应用”(200910021082. 7)、“一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1和应用”(200910021858. 5)、“一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2及其应用”(200910021861. 7)，其存在的不足和缺陷是①“生物发酵提纯苦马豆素的工艺”是由杨凌大农生物技术有限公司申请，中国专利公开号CN1396263，公开日2003年2月12日，专利技术创造的名称为“生物发酵提纯苦马豆素的工艺”，其所采用的微生物菌株是自行从自然界豆科植物中分离、筛选的可产生苦马豆素的豆类丝核菌7-3菌株(代号)。其存在的不足和缺陷是，在专利中没有公开豆类丝核菌7-3菌株的具体获得方法和途径，也没有公开该豆类丝核菌7-3菌株的具体生物学特性、标准、以及品质鉴定方法。这样使得同领域的普通技术人员无法按说明书的内容重复实现。②“绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺”是由西北农林科技大学申请，专利申请号 200610043120. 5，所提供的菌种是从中国农业科学院微生物菌种保存中心购买的标准绿僵菌(Metarrhizium anisopliae)。该专利保护的主要内容是苦马豆素的提取技术工艺,而不涉及绿僵菌本身的分离方法。绿僵菌在自然界中分布比较广泛，目前可以从多种植物，包括土壤中分离得到，仅中国农业科学院微生物菌种保存中心保存的标准绿僵菌菌株就有几十种之多，具体是哪一种专利中不清楚。③“白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺”是由杨凌天力生物技术有限公司申请，专利申请号200710199249. X，所提供的菌种是从中国农业科学院微生物菌种保存中心购买的标准白僵菌(Beauveria bassiana Vuill)，编号为ACCC30112，也可以是其它渠道获得的白僵菌。该专利保护的主要内容也是苦马豆素的提取技术工艺，而不涉及白僵菌本身的分离方法。白僵菌在自然界中分布比较广泛，目前可以从多种植物，包括土壤中分离得到，仅中国农业科学院微生物菌种保存中心保存的标准绿僵菌菌株也有几十种。④“一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌及其制备方法和应用”、“一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1和应用”和“一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2及其应用”3个专利共同的不足是没有公开菌株的种类，且所公开的编号菌株苦马豆素产量偏低。
技术实现思路
本专利具体涉及小花棘豆中产苦马豆素的内生真菌的分离方法及所得产苦马豆素菌株层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)。下面对本专利技术进行详细说明。I)内生真菌分离用去离子水洗去小花棘豆(采自内蒙古阿拉善盟)表面的尘土，用灭菌的镊子将植物的叶、茎、花分离，然后将叶、茎、花分别用纱布包扎，进行表面消毒，表面消毒的程序为首先用75%的乙醇浸泡30s，再用有效氯含量为I %的次氯酸钠溶液浸泡3min，最后用灭菌的去离子水冲洗2次，每次lmin，将该去离子水接种于新制的PDA琼脂培养基表面，观察3d，看该培养基表面是否有真菌生长，以此来检验表面消毒的效果；用灭菌滤纸吸去经表面消毒的植物组织上的水分，然后用灭菌的剪刀将叶、茎、花等分别剪成3mm大小的组织块，然后将各组织块接种于水琼脂培养基表面，置培养箱中18°C培养；待组织块周围长出适当大小的菌落时，挑取边缘菌丝接种于PDA琼脂培养基表面，置培养箱中18°C培养；若在PDA培养基上生长的菌落仍未纯化时，将其再次接种于新制的PDA培养基表面，重复此操作过程，直至得到纯化的菌株。将分离得到的6株内生真菌编号，分别接种于PDA试管斜面，于4°C中保存，24h后转本文档来自技高网...
【技术保护点】
小花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离方法，其特征在于，包括步骤：1)小花棘豆中内生真菌的分离：将小花棘豆表面灭菌，灭菌程序：先用75％乙醇漂洗30～60s，无菌水清洗3次，0.1％升汞溶液漂洗2～5min，无菌水冲洗，取最后一次冲洗所得无菌水滴入PDA培养基平板，25℃培养48h，观察培养基表面有无菌落生长，以此验证植物表面消毒是否彻底。将表面消毒彻底的样品剪成0.5cm×0.5cm组织块，植于PDA培养基，25℃培养3～5d，待组织创缘菌丝长出时，用接种针挑出菌丝并接入新的PDA培养基，纯化培养3～4次，得到纯化菌株，并予以编号。按照上述方法分离纯化得到的菌株，在弃除常见的青霉、黄曲霉、黑曲霉等杂菌后，分别接种于PDA试管斜面培养，于？20℃冰箱作长期保存，PDA固体培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000mL；2)内生真菌生物发酵：取上述分离纯化得到的菌株接种于PDA培养基平板，25℃培养至处于对数生长期时，采用打孔计量法分别接入1号液体培养液，25℃发酵培养14d。1号液体培养液配方：蔗糖26g，磷酸氢二钾3g，硝酸钠3g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，酵母浸膏3g，水1000mL；3)发酵液及菌丝体中苦马豆素定性、定量检测：定性检测：采用薄层色谱法，收集发酵液，减压浓缩至膏状，酸碱处理，水饱和正丁醇萃取6～7次，收集正丁醇萃取液，减压浓缩后用95％无水乙醇溶解制成待检液备用，超声协助乙醇萃取菌丝体中此生代谢产物，收集萃取液，余下步骤同发酵液，制成待检液备用，采用薄层层析技术，用苦马豆素标准品作对照，待检液用毛细管点于自制硅胶GF254薄层板上，置于V氯仿∶V甲醇∶V氨水∶V水＝70∶26∶2∶2展开剂上行展开，展开结束后取出挥干，双氧水/醋酐乙醇/对二甲氨基苯甲醛“三步显色法”显色，观察待检样品在薄层板上的位置 和斑点颜色，记录颜色并计算Rf值；定量检测：采用气相色谱法，用吡啶溶解苦马豆素标准品并做梯度稀释，加硅烷化试剂混合，室温下作用20min，取样进行气相色谱测定，色谱条件为：柱温200℃，进样口温度300℃，FID检测器温度280℃，载气为氮气，载气压力200kPa，流速为2mL/min，进样量2μL，分流比60∶1(AT.SE？54型毛细管色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm，中科院兰州化学物理研究所色谱技术研究开发中心)。以苦马豆素对应峰面积为横坐标，苦马豆素浓度为纵坐标制作标准曲线，然后根据标准曲线方程，计算出样品中苦马豆素含量；4)产苦马豆素内生真菌鉴定：形态学鉴定：将菌种接种于PDA培养基，待菌落长至合适大小，观察菌落、菌丝、产孢结构、分生孢子梗着生情况、孢子形态与颜色等特征，采用插片法提取PDA培养基中自然生长态菌丝，中性树胶封片，置400倍显微镜下观察菌丝和孢子形态，并拍照记录。根据菌落、菌丝和孢子形态等特征参考《真菌鉴定手册》进行初步分类鉴定；分子生物学鉴定：提取内生真菌基因组DNA，采用真菌鉴定通用引物：ITS1(5’？TCCGTAGGTGAACCTGCGC？3’)和ITS4(5’？TCCTCCGCTTATTGATATGC？3’)扩增核糖体rDNA基因中的ITS序列，将目的序列于NCBI上进行BLAST，结合形态学鉴定结果选取同源性高的菌种，然后采用Mega4.0软件N？J法进行聚类分析，自展次数1000次，构建内生真菌系统发育树进行种属归类，结合上述两种方法鉴定内生真菌种属关系；5)得出产苦马豆素内生真菌：通过上述方法鉴定出一株产苦马豆素内生真菌，该菌为层出镰刀菌(Fusarium？proliferatum)，其发酵液中苦马豆素产量为16.7338mg/L。...
【技术特征摘要】
1.小花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离方法，其特征在于，包括步骤 .1)小花棘豆中内生真菌的分离 将小花棘豆表面灭菌，灭菌程序先用75%乙醇漂洗30 60s，无菌水清洗3次，0. 1%升汞溶液漂洗2 5min，无菌水冲洗，取最后一次冲洗所得无菌水滴入PDA培养基平板，.25°C培养48h，观察培养基表面有无菌落生长，以此验证植物表面消毒是否彻底。将表面消毒彻底的样品剪成0. 5cmX0. 5cm组织块，植于PDA培养基，25°C培养3 5d，待组织创缘菌丝长出时，用接种针挑出菌丝并接入新的PDA培养基，纯化培养3 4次，得到纯化菌株，并予以编号。按照上述方法分离纯化得到的菌株，在弃除常见的青霉、黄曲霉、黑曲霉等杂菌后，分别接种于PDA试管斜面培养，于-20°C冰箱作长期保存， PDA固体培养基配方马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水IOOOmL ； . 2)内生真菌生物发酵 取上述分离纯化得到的菌株接种于PDA培养基平板，25°C培养至处于对数生长期时，采用打孔计量法分别接入I号液体培养液，25°C发酵培养14d。I号液体培养液配方蔗糖.26g，磷酸氢二钾3g，硝酸钠3g，硫酸镁0. 5g，氯化钾0. 5g，硫酸亚铁0. Olg，酵母浸膏3g，水IOOOmL ； .3)发酵液及菌丝体中苦马豆素定性、定量检测 定性检测采用薄层色谱法，收集发酵液，减压浓缩至膏状，酸碱处理，水饱和正丁醇萃取6 7次，收集正丁醇萃取液，减压浓缩后用95%无水乙醇溶解制成待检液备用，超声协助乙醇萃取菌丝体中此生代谢产物，收集萃取液，余下步骤同发酵液，制成待检液备用，采用薄层层析技术，用苦马豆素标准品作对照，待检液用毛细管点于自制硅胶GF254薄层板上，置于V氣仿V_: V水=70 26 2 2展开剂上行展开，展开结束后取出挥干，双氧水/醋酐乙醇/对二甲氨基苯甲醛“...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵宝玉，刘生武，苏东，卢围，陈基萍，胡波，刘彤，陈燕，刘媛，
申请(专利权)人：鄂尔多斯市普众生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。