本发明专利技术涉及一种检测猪繁殖与呼吸综合症病毒血清抗体的多重表位融合抗原，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。本发明专利技术还涉及该多重表位融合抗原的制备方法，及检测猪繁殖与呼吸综合症病毒抗体的试剂盒。本发明专利技术制备的多重表位融合抗原纯度高，稳定性好，而且制备工艺简单，成产成本低，所述试剂盒的检测灵敏度高，安全性强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测猪繁殖与呼吸综合症病毒血清抗体的多重表位融合抗原及其制备的试剂盒。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合症(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)，俗称猪蓝耳病，是80年代末出现的一种新的猪传染性疾病，其病原体是猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respirator syndrome virus,PRRSV)。I987年美国首先报道了该病的发生，其症状主要表现为怀孕母猪发生流产、早产、死胎和木乃伊等严重的繁殖障碍，仔猪呼吸系统症状和断奶前死亡率增高，育成 猪呼吸困难，发育迟缓，公猪性欲减退精液品质下降等。1991年欧洲爆发了毁灭性流行，造成了近百万头猪死亡。中国于1996年由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所首次从国内疑似猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的猪场中分离到猪繁殖与呼吸综合症病毒，确认了本病在国内的发生和流行。2003年起许多专家都惊呼“全国猪场一片蓝”，猪繁殖与呼吸综合症病毒的高感染率是一个不争的事实。更为令人担忧的是，2006年夏季，中国中南部爆发了高致病型猪繁殖与呼吸综合症，之后蔓延到全国各个省市。高致病型猪繁殖与呼吸综合症的特点是能使不同年龄和不同品种的猪都感染发病，且发病率高、病死率高、治愈率低。2007年，国内共有26个省份发生了高致病型猪繁殖与呼吸综合症，发病猪数量达30多万头，许多发病猪场的死淘率甚至达到100%。直至今日，疫病形势依然严峻，高致病型猪繁殖与呼吸综合症病毒已经成为猪的三大致死性病原之首，严重地影响了国内畜牧业生产。由于目前还没有有效的治疗手段，所以对于猪繁殖与呼吸综合症，尤其是高致病型猪繁殖与呼吸综合症，及时、正确的诊断是预报疫情、控制流行态势、防止疫病爆发的首要环节。猪繁殖与呼吸综合症病毒为有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子直径50 65nm,核衣壳25 35nm,表面有明显的纤突,核衣壳呈立体对称的二十面体。该病毒属于套式病毒目(Nidovirales),动脉炎病毒科(Arterivirus)。猪繁殖与呼吸综合症病毒基因组全长约15. 4kb,包括9个开放阅读框架(Open Reading Frame, 0RF),分别编码病毒复制所需要的酶(ORFla和ORFlb)和7个结构蛋白(0RF2a、0RF2b、0RF3 0RF7)。ORFla和ORFlb占基因组全长的3/4，编码的多聚蛋白ppla和pplab最终可水解为14个非结构蛋白(Nonstructural Protein, NSP)。这些NSP编码病毒RNA复制酶，是病毒产生的唯一的非结构性蛋白，参与病毒复制。按照欧洲型猪繁殖与呼吸综合症病毒Lelystad株各非结构蛋白划分，Nsp7的起止位置为Ser 2083 Glu 2351。北美洲型猪繁殖与呼吸综合症病毒VR-2332株Nsp7的起止位置为Ser 2200 Glu2458氨基酸。我国流行的猪繁殖与呼吸综合症病毒主要是北美洲型，主要为高致病性HuM株，由于HuM株较VR-2332株在Nsp2处存在30个氨基酸的缺失，所以HuM株Nsp7的起止位置为Ser 2170 Glu 2428。Nsp7共259个氨基酸，由777个碱基编码。研究显示Nsp7可诱导机体产生高水平的抗体，并能维持较长时间，说明Nsp7与机体免疫应答关系密切。0RF5编码主要的囊膜糖蛋白GP5，0RF2 0RF4分别编码次要结构蛋白GP2a、GP2b、GP3和GP4，GP5与0RF6编码的基质蛋白M形成二聚体，核衣壳蛋白(N蛋白)由0RF7编码。其中，N蛋白在病毒粒子中含量较高，是病毒的优势结构蛋白，约占病毒蛋白总量的20% 40%，同时抗原性最强且具有较好的保守性。猪繁殖与呼吸综合症病毒感染后机体首先产生的是针对N蛋白抗体，并且在体内持续时间最长，因而该蛋白已 作为检测猪繁殖与呼吸综合症病毒血清抗体的诊断抗原。猪繁殖与呼吸综合症的诊断技术包括以下几种(I)临床症状及病理变化即通过临床表现及组织病理改变进行诊断，如发热、咳嗽、呼吸急促等呼吸系统症状，耳部肢体发绀，繁殖猪早产、流产泌乳不足，公猪精液品质下降，仔猪易死亡等。该方法并非特异性诊断方法。(2)病毒的分离培养和检查通过细胞培养观察病毒诱导的细胞病变。该方法需要特定的实验条件，且实验周期长。(3)分子或细胞生物学诊断采用PCR、原位核酸杂交、间接免疫荧光试验、间接免疫过氧化物酶试验等直接检测感染病猪中的猪繁殖与呼吸综合症病毒核酸或抗原。但分子生物学检测操作复杂繁琐，对仪器设备、实验室条件、以及实验人员的技术要求高，检测成本亦相应增加，因此难以在基层单位大规模开展；此外，猪繁殖与呼吸综合症病毒具有抗原变异性的特点，也使得传统的单一抗原检测难以达到预期目的。(4)免疫学诊断常用的方法如免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接荧光抗体试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、血清中和试验(SN)等。其中ELISA在国内外被广泛应用于猪繁殖与呼吸综合症病毒抗体检测。主要原因是由于它有明显优于其它几种方法的优点操作简单，稳定性好，可自动显示结果，特异性敏感性高。对实验室及仪器设备的要求相对较低，易于实现高通量检测，是适于在基层单位推广的检测方法。猪繁殖与呼吸综合症病毒的基因结构和抗原性比较复杂，并且具有抗原变异性的特点，使得单一抗原检测或通过单一抗原检测抗体均难以达到理想的灵敏度。全病毒作为包被抗原的优点是抗原制作方法比较简单，缺点是病毒纯化工艺复杂，费时、费力、成本高，全病毒抗原建立的ELISA检测时有较强的背景反应和非特异性反应，以及不同批次差异较大，有散毒的隐患等。使用完整的病毒颗粒作为标准抗原虽然可具备理想的灵敏度，抗原制作方法也比较简单，但是需要进行病毒培养、灭活、以及灭活后的验证等复杂工艺，费时、费力、成本高，全病毒抗原建立的ELISA检测时有较强的背景反应和非特异性反应，以及不同批次差异较大，具有潜在病毒传播风险的隐患等，这些缺点使得该方法并不适合产业化开发；此外，完整的病毒颗粒作为抗原检测抗体，还容易出现假阳性结果。利用基因工程技术制备重组抗原代替全病毒抗原进行ELISA检测，可避免使用全病毒抗原检测的不足，其优点在于目的蛋白的反应特异性高，且一旦技术路线成熟，可大量稳定的制备。构建多重表位融合抗原是目前检测猪繁殖与呼吸综合症病毒抗体最为理想的策略。基于
现有技术，在对猪繁殖与呼吸综合症病毒各蛋白氨基酸序列进行了充分的生物信息学分析的基础上，我们采用多重表位融合抗原(Multiple-epitope fusionantigen, MEFA)技术,选取了 Nsp7与N蛋白部分残基作为抗原优势表位进行融合抗原的设计与制备，这两部分均可诱导机体产生高水平的抗体，并能维持较长时间。以此多重表位融合抗原作为捕获抗原建立了检测猪繁殖与呼吸综合症病毒抗体的间接ELISA方法，再经过条件的优化使得在达到一定产能(4，8000头份/周)的前提下，该方法所需的各组分都具备了相当的稳定性，从而成功研制出了猪繁殖与呼吸综合症病毒抗体检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测猪繁殖与呼吸综合症病毒血清抗体的多重表本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测猪繁殖与呼吸综合症病毒血清抗体的多重表位融合抗原，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO:1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄洪涛，严俊，姚静，石延宾，张宪，胡伟，江雨丽，李小鱼，魏勇，
申请(专利权)人：重庆业为基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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