表达重组DSBC并具有降低的TSP活性的细菌宿主菌株制造技术

本发明专利技术提供一种重组革兰氏阴性细菌细胞，细胞特征在于：a.包含编码DsbC的重组多核苷酸；以及b.与野生型细胞相比其具有降低的Tsp蛋白质活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】表达重组DSBC并具有降低的TSP活性的细菌宿主菌株本本专利技术涉及重组细菌宿主菌株，特别是大肠杆菌(E.Coli)。本专利技术还涉及在此细胞中产生目的蛋白质的方法。
技术介绍
通常将细菌细胞，如大肠杆菌，用于生产重组蛋白质。使用细菌细胞如大肠杆菌生产重组蛋白质有很多优势，具体而言是因为细菌细胞作为宿主细胞可以使得基因通过质粒插入而具有多祥的属性。大肠杆菌已经用于很多重组蛋白质的生产，包括人胰岛素。尽管使用细菌细胞产生重组蛋白质有很多优势，但是仍然有显著的局限性，包括难以生产蛋白酶敏感型蛋白质。蛋白酶在大肠杆菌细胞周质和细胞质中转换老旧、损坏或折叠错误的蛋白质上起到重要作用。细菌蛋白酶起降解目的重组蛋白质的作用，因此常常显著降低活性蛋白质的产量。·已经鉴定出大量的细菌蛋白酶。大肠杆菌中的蛋白酶包括蛋白酶III(ptr)、DegP、OmpT> Tsp> prlC、ptrA、ptrB、pepA-T、tsn、espc、eatA、clpP ネロ Ion。Tsp(也称为Prc)为ー种60kDa的细胞周质蛋白酶。第一个已知的Tsp底物为青霉素结合蛋白质_3(PBP3)(Determination of the cleavage site involved in C-terminalprocessing of peniciilin—binding protein 3 of Escherichia co_li ; NagasawaH，Sakagami Y,Suzuki A,Suzuki H，Hara H，Hirota Y.J Bacteriol. 1989 Nov;171(11): 5890-3和Cloning，mapping and characterization of the Escherichia coli Tspgene which is involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein3;Hara H，Yamamoto Y,Higashitani A, Suzuki H,Nishimura Y. J Bacteriol. 1991Aug; 173 (15) :4799-813),但后来发现Tsp还能够裂解噬菌体尾巴蛋白质，因此将其改名为尾特异性蛋白酶(Tail Specific Protease, Tsp ) (Silber 等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 89:295-299 (1992))。Silber 等人(Deletion of the prc (tsp) gene providesevidence for additional tail-specific proteolytic activity in Escherichia coliK-12; Silber, K. R. , Sauer, R. T. ;Mol Gen Genet 1994242:237-240)描述了ー种prc删除菌株(KS1000)，其中的突变是通过将包含Kanr标记物的片段取代prc基因的片段而形成的。Tsp (prc)活性降低对降低目的蛋白的蛋白水解是可取的。然而，发现缺少蛋白酶prc的細胞在低滲透压下显示出热敏感生长概況。Hara等人分离了含有基因外抑制子(spr)突变的耐热性回复突变株(Hara等人，Microbial Drug Resistance, 2:63-72(1996))。spr为ISkDa的膜结合细胞周质蛋白酶，spr的底物为Tsp以及外膜中参与細胞分裂中細胞壁水解的肽聚糖。spr基因标记为UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4(SPR—EC0LI)。包含有突变spr基因的蛋白酶缺陷菌株已有描述。Chen et alCChen C，SnedecorB，Nishinara JCj Joly JC，McFarland N，Andersen DC,Battersby JE，ChampionKM. Biotechnol Bioeng. 2004 Mar 5;85 (5) :463-74)描述了携带 prc (Tsp)及另ー种蛋白酶DegP的不同突变组合的大肠杆菌菌株的构建，是通过扩增基因上游及下游区域并将其一起连接于包含选择性标记物及sprW174R突变的载体上而产生的(重组抗体片段在大肠埃希式杆菌的細胞周质中高水平积累需要三重突变体(ADegP Aprc SprW174R)宿主菌株。发现ADegP、Aprc和SprW174R突变的组合提供最高水平的抗体轻链、抗体重链及F(ab，) 2-LZ。EP1341899公开了在编码蛋白酶DegP和Prc的染色体DegP和prc分别有缺陷的大肠杆菌菌株，此菌株还具有突变spr基因，其编码的蛋白质抑制了包含prc突变体的菌株表现出的生长表型。蛋白质_■硫键异构酶为在蛋白质折置时，[隹化其中半]]光氣Ife残基见_■硫键形成和断裂的酶。已知其与催化ニ硫键形成的蛋白质共表达而改善宿主细胞中的蛋白质表达。W098/56930公开了ー种在细菌中产生含ニ硫键的异源多肽的方法，其中原核ニ硫键异构酶如DsbC或DsbG与真核多肽共表达。US6673569公开了包含编码DsbA、DsbB, DsbC和DsbD中每种的多肽的人工操纵子，用于产生外源蛋白质。EP0786009公开了用于在细菌中生产异源多肽的过程，其中在诱导编码异源多肽的核酸表达之前诱导编码DsbA或DsbC的核酸表达。DsbC是ー种发现于大肠杆菌细胞周质中的原核蛋白质,其催化大肠杆菌中二硫键的形成。DsbC的氨基酸序列长度为236 (包括信号肽)，分子量为25.6KDa (UniProt No. POAEGGXDsbC于 1994年首次发现(Missiakas等人The Escherichia coli dsbC(xprA)gene encodes a periplasmic protein involved in aisulfiae bond formation, TheEMBO Journal vol 13, no 8，p2013-2020, 1994 以及 Shevchik 等人 Characterization ofDsbC, a periplasmic protein of Erwinia chrysanthemi and Escherichia coil withdisulfide isomerase activity, The EMBO Jounral vol 13,no 8，p2007_2012，1994)。出乎意料地发现在革兰氏阴性细菌细胞中由重组DsbC过表达DsbC改善了缺乏蛋白酶Tsp的细胞的细胞裂解表型。因此，本专利技术提供了新菌株，其具有用于产生目的蛋白质的优势特性。专利技术概述本专利技术提供了重组革兰氏阴性细菌细胞，细胞的特征在于a)包含编码DsbC的重组多核苷酸；以及b)与野生型细胞相比，具有降低的Tsp蛋白质活性。在一个实施方式中，细胞包含野生型spr基因。在此实施方式中，优选地，除了降低Tsp蛋白质活性所需的修饰之外，细胞基因组与野生型细菌细胞是同基因的。在一个进ー步的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.01.14 GB 1000591.61.重组革兰氏阴性细菌细胞，特征在于所述细胞 a.包含编码DsbC的重组多核苷酸；并且 b.与野生型细胞相比，具有降低的Tsp蛋白质活性。2.根据权利要求I的细胞，其中所述细胞进ー步包含编码突变spr蛋白质的突变spr基因。3.根据权利要求2的细胞，其中所述突变spr基因编码的spr蛋白质在选自H157、N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144、H145 和G147的ー个或多个氨基酸处具有突变。4.根据权利要求3的细胞，其中所述突变spr基因编码的spr蛋白质具有选自H157A、N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D、V135G、L136P、G140C、R144C、H145A 和 G147C 的ー个或多个突变。5.根据权利要求4的细胞，其中所述spr蛋白质的ー个或多个选自S95F、V98E、Y115F、D133A、V135D、V135G 和 G147C。6.根据权利要求5的细胞，其中所述突变spr基因编码的spr蛋白质具有突变S95F和Y115F。7.根据权利要求4的细胞，其中所述突变spr基因编码的spr蛋白质具有选自C94A、D133A、H145A 和 H157A 的突变。8.根据任何前述权利要求的细胞，其中所述细胞进ー步包含ー种或多种以下突变基因 a.编码具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白质的突变DegP基因； b.突变Ptr基因，其中所述突变ptr基因编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III或其为敲除突变Ptr基因；以及 c.突变OmpT基因，其中所述突变OmpT基因编码具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白质或其为敲除突变Omp...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·埃里斯，D·P·哈姆费雷斯，
申请(专利权)人：UCB医药有限公司，
类型：发明
国别省市：