细胞的选择性裂解制造技术

本发明专利技术公开了用于选择性裂解包含微生物例如细菌的样品中的细胞的方法和装置。通过将样品在碱性条件下在非离子型去污剂中孵育而获得该选择性裂解。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及真核细胞，特别是动物细胞，例如血细胞的裂解。本专利技术还涉及具有高浓度的其他细胞的样品中的低浓度微生物例如细菌的检测。
技术介绍
分子诊断g在快速检测样品例如血液中的微量病原体(通常是细菌)。然而血液是复杂的基质，且包含用于获得性免疫系统的白细胞(white blood cell)(白细胞(leukocyte)),用于运输氧的红细胞(red blood cell)(红细胞(erythrocyte))和用于伤ロ愈合的血小板(凝血细胞)。这使包含高量的细胞物质的样品例如全血中的病原体的直接检测变得复杂。 经典的检测方法包括在选择性培养基和/或带有指示剂的培养基上培养细菌。通常，在可进行鉴定之前，这些測定需要至少I或2天的培养步骤。对于基于PCR的方法，新鮮血液样品中细菌的量理论上是足够高以被检测的而无需进一歩培养该样品内存在的细菌。然而，为实现微量细菌的早期检测，需要大体积的血液。特别是白细胞中的高量的DNA明显升高了基于DNA的检测方法中的背景。另外，血红蛋白中血红素的存在强烈降低了 DNA聚合酶的活性。I微升的人血包含约4，000至11，000个白细胞和约150，000至400，000个血小板。血液中DNA的浓度在约30和60 μ g/ml之间。检测体积为IOml的全血中约10至100，000的细菌物种的存在是非常有挑战性的。白细胞的高量DNA可产生不相关的PCR产物，或可清除为检测细菌DNA而设计的引物。这使得在可通过PCR或其他方法检测细菌DNA之前彻底纯化DNA和分离哺乳动物DNA成为必要。除了干扰PCR反应本身，哺乳动物DNA的量增加样品的粘度。另外，来自裂解过的哺乳动物细胞的蛋白质和膜形成阻碍样品过滤的复合物。这对于微型装置特别成问题。进一歩稀释已经大的样品体积导致不可接受的长的操作步骤。由于以上原因，所以需要去除血液样品中的人DNA的方法。在哺乳动物DNA存在下专门测定细菌DNA的方法是已知的。来自SIRSLab公司的Looxter 使用了富集样品中甲基化DNA的方法。由于细菌DNA是高度甲基化的，该方法促使富集细菌DNA。来自Molzym公司的Molysis 使用了离液剂和去污剂来选择性裂解哺乳动物细胞。该裂解步骤之后为用不受该离液剂/去污剂影响的DNA酶消化。例如由Roche商业化的替代性方法(S印tifast )依赖于为防止非特异性结合人DNA和扩增人DNA而设计的PCR引物对。US 6，803，208描述了ー种方法，其中在37°C下裂解掺杂细菌的血小板的高度稀释的悬浮液15分钟，随后在0. 4 μ m滤器上过滤小量的裂解样品以目视检查截留在滤器上的细菌是可能的。然而该方法不允许在环境温度下处理大体积的样品。专利技术概述在所附独立和从属权利要求中列出了本专利技术的具体和优选的方面。可适当地将从属权利要求的特征与独立权利要求的特征和与其他从属权利要求的特征组合而不仅限于这些权利要求中明确列出的特征。本专利技术的ー个方面涉及用于选择性裂解包含或疑似包含微生物的样品中的真核细胞，特别是动物细胞的方法。该方法包括以下步骤提供包含或疑似包含微生物的带有真核细胞，特别是动物细胞的样品，向该样品中加入非离子型去污剂和缓冲液以获得具有约9.5或更高的pH的溶液，和将该溶液孵育足够长的时间段例如30秒和10分钟之间，更优选2和6分钟之间以裂解所述真核细胞，特别是动物细胞。在具体实施方式中，可在15至30°C下，更优选接近室温下进行裂解。 在具体实施方式中，样品是哺乳动物血液样品例如全血。在其他具体实施方式中，微生物是细菌或真菌。根据具体实施方式，其中所加入的去污剂和所加入的缓冲液的体积与样品的体积之间的比例在2/1和1/10之间。在具体实施方式中，非离子型去污剂选自包含Nonidet、Brij、吐温、Igepal、还原型triton、辛基葡糖苷、cholaat和Triton的组。更优选的实例是Triton X_100、NonidetP40、脱氧胆酸钠和或Ig^alCA 630。在具体实施方式中，本文所用的碱性缓冲液具有大于9的pKa值。其实例是硼酸盐、碳酸盐、CAPS (N-环己基-3-氨基丙磺酸)、CAPSO (3-(环己基氨基)-2-羟基-I-丙磺酸)、CHES (2-(N-环己基氨基)こ磺酸)、焦磷酸盐和こ醇胺。特别的实例是碳酸钠。缓冲液应具有足够的缓冲能力以致于当与样品以根据本专利技术的比例混合时，最終溶液的PH为约9. 5或更高。在具体实施方式中，该方法还包括在滤器上过滤经孵育的溶液的步骤，该滤器具有在所述滤器上截留微生物的孔径(pore size)，例如具有小于0.7 μ m，更优选小于0.5 μ m的孔径的滤器。本专利技术的方法有助于过滤大体积的样品而没有酶或加热相关的处理步骤。在具体实施方式中，该方法还包括在根据本专利技术的选择性裂解后加入酸或酸性缓冲液以获得约7和9之间的pH的步骤，“中和步骤”。 在具体实施方式中，上述方法之后是微生物检测。其实例是细胞计量术、显微木、PCR或培养。在具体实施方式中，上述方法之后是微生物裂解。本专利技术的另一方面涉及用于检测样品中微生物的装置(I)，包括用于接收体积低于40ml，优选低于20ml且优选I和20ml之间的样品流体的裂解室(2)，与裂解室连接的，包含具有约9. 5或更大的pH的碱性缓冲液且包含非离子型去污剂的储存室(3)，或包含pH约9. 5或更大的碱性缓冲液的储存室(31)，包含非离子型去污剂的储存室(32)，与所述裂解室连接的用于过滤裂解后样品的滤器(4)，所述滤器具有在滤器上截留细菌的孔径，和用于测定DNA存在的检测室(5)。本文的碱性缓冲液通常具有高于9. 5的pKa，因此最终溶液将具有约9. 5或更高的pH,且非离子型去污剂通常是Triton X-100、脱氧胆酸钠、Nonidet P40和/或Igepal CA630。本专利技术中所述的方法允许选择性裂解样品中的白细胞和红细胞，而细菌和真菌保持完好(死亡的或存活的)。本专利技术中所述的方法使处理样品而不显著稀释该样品成为可能，且因此允许处理较大体积的样品。另外，不需要通过例如DNA酶来酶促降解DNA或使用加热，使得该方法与现有技术已知的方法相比复杂度较低。本专利技术中所述的方法产生具有低粘度和最小聚集的裂解样品，这使得在截留细菌的滤器上过滤大体积的裂解样品成为可能。可以约100-1000 μ I之间的体积在该滤器上进ー步处理细菌，这使得处理大的样品体积以用于随后的步骤和在集成柱中完全自动进行所需要的操作例如中和和洗涤成为可能。从以下详述结合通过实例阐释本专利技术的原理的附图，本专利技术的上述和其他特点、特征和优点将变得明显。仅为了举例目的而不限制本专利技术的范围，提供了本说明书。以下引用的參考图是指附图。附图简述 图I示出了在根据本专利技术的方法的具体实施方式的不同pH值下选择性裂解之后的大体积血液的过滤效率。图2示出了在根据本专利技术的方法的具体实施方式的不同pH值下选择性裂解之后不同细菌的回收。图3示出了在根据本专利技术的方法的具体实施方式的不同孵育时间下选择性裂解之后不同细菌的回收。图4示出了通过根据本专利技术的选择性裂解人背景DNA的減少。图5和6分别示出了 Iml和5ml全血中不同类型病原体的检测。图7示出了本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.12.08 EP 09178363.91.一种选择性裂解包含或疑似包含微生物的样品内的真核细胞的方法，所述方法包括以下步骤 a)提供包含或疑似包含微生物的带有真核细胞的样品， b)向所述样品中加入非离子型去污剂和缓冲液以获得具有约9.5或更高的pH的溶液； c)将所述溶液孵育足够长的时间段以裂解所述真核细胞。2.根据权利要求I所述的方法，其中所述样品是哺乳动物血液样品。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述血液样品是全血。4.根据权利要求I至3中任一项所述的方法，其中所述微生物是细菌。5.根据权利要求I至3中任一项所述的方法，其中所述微生物是真菌。6.根据权利要求I至5中任一项所述的方法，其中所述孵育步骤c)进行30秒和10分钟之间。7.根据权利要求I至6中任一项所述的方法，其中加入的去污剂和加入的缓冲液的体积与样品的体积之间的比例在2/1和1/10之间。8.根据权利要求I至7中任一项所述的方法，其中所述非离子型去污剂以O.1%和5%(w/v%或v/v% )的浓度存在。9.根据权利要求I至8中任一项所述的方法，其中所述非离子型去污剂选自包括Nonidet...

【专利技术属性】
技术研发人员：巴特·爱德华·古斯塔·约瑟夫·凡米尔伯根，欧娜·米哈埃拉·皮丘，朗·吉尔，克里斯蒂安·安妮·施密特，西格林德·尼尔肯，马克·威廉默斯·吉斯波特·彭杰，泽伊内普·塞弗莱克·维奈，罗埃尔·彼得曼，保罗·阿诺德·凡德维尔，
申请(专利权)人：比奥卡尔齐什股份有限公司，
类型：发明
国别省市：