生殖系干细胞储存系统技术方案

本发明专利技术提供了用于分离、表征、冷冻保存和储存人类生殖系干细胞和性腺组织的方法和系统。还公开了移植冷冻保存的细胞以再迁入不育的繁殖器官的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及下述系统，所述系统储存来自由于损伤其生殖系干细胞(germlinestem cell)而处于生育力风险的患者的生殖系干细胞并在稍后的日子恢复患者的生育力。具体地，本专利技术涉及收集和分离生殖系干细胞、处理细胞并冷冻保存和测定细胞的繁殖能力。本专利技术还公开了恢复患者生育力的的方法，生殖系干细胞分离自所述患者。
技术介绍
生殖系干细胞存在于繁殖器官即卵巢和睾丸中，它们潜在地代表哺乳动物体内最重要、最受保护的干细胞种类之一。已报道了在得自这些组织的干细胞中的遗传保守和高端粒酶活性，以及由染色质染色体修饰的广泛的DNA修饰。科学家们对于成年繁殖组织中存在何种干细胞以及它们在分化中的潜能持不同观点。化学疗法和放射治疗不但以癌细胞为目标，还以快速分裂细胞为目标。在睾丸中，快速分裂的生殖细胞对这些暴露是高度敏感的。在青春期前的睾丸中，生殖系干细胞同样敏感并在放射暴露后严重地剂量依赖性地衰竭。低剂量的细胞毒性药物或辐射使分化的精原细胞衰竭，而较不敏感的精原干细胞以及精母细胞和精细胞可存活。分化中的生殖细胞可继续它们的成熟成为精子细胞，并可用产生于存活的干细胞群的干细胞再定殖(re-colonize)生精小管(seminiferous tubule)。然而，在严重衰竭的情况下，精子生成仅可在非常少的生精小管中恢复，从而限制生育力。在睾丸干细胞全部衰竭后患者会永久性的不育。对精子生成的影响在青春期时或之前表现得最严重，因为精子典型地不能在青春期后雄性中获得和冷冻保存。如果给予足够的时间重新开始精子生成，甚至少数干细胞可再定殖生精小管。直到最近，人们相信，包括人类的大多数哺乳动物物种的雌性性腺，容纳有封在原始卵泡内的有限数目的减数分裂-停止的生殖细胞(卵母细胞)，其作为在每个月经周期期间排卵时释放的卵的储备库存。通过多种机制包括细胞凋亡，卵母细胞数目在出生后生命期间减少，其被广泛认为最终导致卵巢不再含有生殖细胞。人类中，卵母细胞储备耗尽典型地在生命的第五个十年期间发生，而推动绝经。根据这些基本的繁殖生物学理论，人们还认为，一旦衰竭，卵巢生殖细胞库不能再补充。因此，加速卵母细胞损失的任何治疗对生育力下降有危险并会在比期望的更早的年龄引起绝经。例如，女性暴露于损伤卵巢的广范围的试剂(例如化疗剂和放射疗法)，通常导致过早绝经和不可逆的不孕。目前，在各种不利条件下保存生育力和正常卵巢功能的有限的治疗选择(例如，冷冻保存卵巢组织碎片或单个卵母细胞)是侵入性的并通常需要在先的激素疗法，这对许多患有激素反应性肿瘤的女性而言可能是医学上不适当的。而且，目前没有能推迟绝经期的正常卵巢衰退的治疗选择。已发现了针对在雄性和雌性二者中恢复功能性生殖细胞的两种主要途径。第一种是在存活的组织上移植(graft)未成熟组织(卵巢或睾丸)的组织碎片，第二种以干细胞的分离和移植为基础。生殖细胞移植已在啮齿动物模型中开发。将来自小鼠或密切相关物种的生殖细胞显微注射进小鼠的生精小管再次刺激了从供体精原干细胞的精子生成。在转移之前，精原细胞可被冷冻保存或培养。类似地，冷冻保存的卵巢皮质组织已在绵羊和人类中移植，引起发情恢复并在正常交配后产生活的后代。因此,需要人类的生殖系细胞储存系统(banking system),以恢复没有能力储存成熟的精子或卵子的患者的繁殖潜能
技术实现思路
本公开提供了提供了生殖系细胞储存系统，其包括从雄性和雌性二者中收集、分离、扩展、处理、冷冻保存、检验、释放和移植生殖系细胞的方法。在本文公开的一种实施方式中，提供了储存生殖系干细胞的方法，其包括从处于生育力丧失风险下的哺乳动物中收集性腺组织；将所述性腺组织运输至中心储存设施；处理所述性腺组织；冷冻保存所述性腺组织；并测定所述冷冻保存的性腺组织的生育力潜倉泛。在本方法的一种实施方式中，性腺组织是睾丸组织。在另一种实施方式中，处理睾丸组织包括制备约0.5-2. 0mm2的睾丸组织片。在另一种实施方式中，处理睾丸组织包括用选自下述组的至少一种酶消化所述睾丸组织胶原酶、DNase、透明质酸酶和胰蛋白酶；并使所述至少一种酶失活，因而获得离解的睾丸细胞的悬液。在另一种实施方式中，方法还包括从所述离解的睾丸细胞中分离雄性生殖系干细胞的步骤，其中所述雄性生殖系干细胞特征在于它们不表达黄体生成素受体。在另一种实施方式中，方法还包括从所述离解的睾丸细胞中分离雄性生殖系干细胞的步骤，其中所述雄性生殖系干细胞特征在于它们表达SSEA-4。在另一种实施方式中，雄性生殖系干细胞还表达GFR-α I和VASA。在本专利技术的另一种实施方式中，测定生育力潜能是所述睾丸组织体外分化为成熟的精子的能力。在另一种实施方式中，测定生育力潜能是通过减数分裂标记物和减数分裂后的标记物的表达以及尺寸和形态学的至少一种来测定睾丸细胞的特征。在本方法的一种实施方式中，性腺组织是卵巢组织。在另一种实施方式中，处理卵巢组织包括制备制备约O. 5-3. Omm2卵巢组织片。在另一种实施方式中，处理还包括用选自下述组的至少一种酶消化所述卵巢组织胶原酶、DNase、透明质酸酶和胰蛋白酶；并使所述至少一种酶失活，因而获得离解的卵巢细胞悬液。在另一种实施方式中，测定生育力潜能通过所述卵巢组织体外分化为成熟的卵子的能力来进行测定。在另一种实施方式中，测定生育力潜能是通过减数分裂标记物和减数分裂后的标记物的表达以及尺寸和形态学的至少一种来测定卵巢细胞的特征。在另一种实施方式中，所述方法还包括将所述冷冻保存的性腺组织植入从中分离该性腺组织的相同个体的剩余性腺组织中。在本文公开的一种实施方式中，提供了生殖系干细胞储存系统其包括，收集性腺组织的手段；运输性腺组织的手段；处理性腺组织以分离生殖系干细胞的手段；冷冻保存性腺组织或所述生殖系干细胞的手段；测所述冷冻保存的性腺组织或所述冷冻保存的生殖系干细胞的生育力潜能的手段。附图简沭图I描绘了使用流式细胞计量术从转基因0G2小鼠中分离的睾丸干细胞GFP(绿色荧光蛋白)阳性亚群的富集。GFP表达 指出的Oct-4阳性细胞在与野生型(附图说明图1A)比较的新生(图1B)和成年(图1C)0G2小鼠二者中作为不同的细胞群体被发现。在Oct-4阳性细胞中，发现由c-Kit阳性(R5)和c-Kit阴性(R2)组成的两种清晰的亚群(图1D-1E)。还展示了 GFP和c-Kit表达之间的关联(图1F-1H)。图2描绘了培养物中专能生殖细胞(mGC)系发育期间的形态改变。在培养前于细胞制备物中观察小鼠0ct-4+/GFP+细胞(图2A ;箭头；第1-3天)。培养后不久观察到Oct-4的下调(图2B;第3-7天)。在培养第二周细胞黏附后，发生明显的形态改变(图2C第7-15天；图2D第15-20天)。培养约三周后，形成含有小圆细胞的集落(图2E ;第20-30天)。培养约一个月后观察到Oct-4的上调(图2F ;第30-40天)。图2G-I中分别展示了来自于新生0G2、成年0G2或新生0G2-LacZ的三种确立的mGC株系的图像(图2G，新生0G2 ；图 2H，成年 0G2 ;图 21，0G2LacZ)。标度棒50ymo图3描绘了在补充有15%胎牛血清(FBS)的PM_1 培养基中，在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上培养的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：法里波茨·伊扎德亚尔，乔尔·马瑞，查德·马科，詹森·帕基奥罗缇，托马斯·拉莫斯，凯尔·霍尔顿，杰林德·王，马涅·奥尔姆斯蒂德，周永强，康斯坦斯·袁，
申请(专利权)人：普里梅真生物技术DBA瑞坡司铁有限责任公司，周永强，
类型：发明
国别省市：