本发明专利技术提供了一种检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）活性的化学发光检测试剂盒，它包含有：链霉亲和素磁珠，生物素化的O6-苄基鸟嘌呤，O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶特异性抗体anti-MGMT的酶标记物，O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶标准品溶液，发光底物液，浓缩洗涤液。本发明专利技术还公开了一种应用上述试剂盒用于MGMT的检测方法，它包括步骤：首先进行样品总蛋白质提取，然后采用试剂盒检测，最后分析检测结果。本发明专利技术提供了一种检测人组织或细胞中的MGMT活性的化学发光检测试剂盒及检测方法，具有操作简便、快速，检测结果灵敏度高、特异性强等诸多优点，在MGMT活性临床检测方面具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的化学发光检测试剂盒及其检测方法。(ニ)
技术介绍
O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶(O6-Methylguanine DNA-Methyltransferase,MGMT)是ー种高效的DNA修复酶，能够修复化疗中烷化剂药物对肿瘤细胞DNA所造成的损伤，如果肿瘤细胞中的MGMT活性达到一定水平则可能会导致耐药性，因此，MGMT活性的高低为耐药与否提供直接信息，MGMT活性检测对评估化疗效果以及减少药物毒副作用有着重要的意义。不幸的是，目前还没有ー种简易可靠、可应用于常规临床检验的方法来測定具有重要肿瘤学价值的MGMT活性。已有大量文献描述MGMT基因启动子甲基化以及MGMT蛋白表达的免疫测定并试图建立这些分子生物学和血清学指标与肿瘤耐药性、生存率以及个体化治疗方案的相关性，但这些烦琐而且不稳定的检测方法不适合在临床上常规使用，也因为 它们不直接測定MGMT的酶学活性而可能引入各种与肿瘤耐药机制无关的干扰因素。基于同位素标记底物的MGMT活性測定法只适用于实验室研究而难以被用于常规临床检验中；此外，这种方法所用的蛋白沉淀步骤容易引入诸如黑色素(Melanin)等蛋白的非特异结合，引起假阳性。虽然有人用非同位素标记的底物和酶联免疫分析方法来測定MGMT活性，但这个方法需要多步而费时的固相分离和反应。从临床应用和检测效率(灵敏度)的角度来看，这是个明显的缺点。很明显，无论在肿瘤生物学的基础研究中还是在肿瘤治疗的临床实践中，都急需发展ー种简单可靠的方法来特异、灵敏地測定各种肿瘤组织和细胞中的MGMT活性。专利
技术实现思路
本目的是提供ー种简便、特异、灵敏的MGMT活性的化学发光检测试剂盒及其检测方法。本专利技术采用的技术方案是一种检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的化学发光检测试剂盒，主要包括试剂I :链霉亲和素磁珠浓度为r5mg/mL的分散液，溶剂为含有O. 5% (w/w)牛血清白蛋白、1% (w/w)酪蛋白的pH 7. 2、0. 02mol/L的磷酸盐缓冲液；所述链霉亲和素磁珠为表面修饰链霉亲和素的磁性微球，粒径为Γ3μπι，内核为四氧化三铁(Fe304)、表面带有链霉亲和素生物分子，可通过戊ニ醛两步法在表面带有羧基或氨基等活性基团的磁性微球以化学共价结合方式引入链霉亲和素，并以含有O. 5%牛血清白蛋白(bovine serumalbumin, BSA)、1%酪蛋白的pH为7. 2,0. 02mol/L的磷酸缓冲液进行封闭完成试剂2 :生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的底物，即生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤溶液，使用时以含有叠氮钠O. 2g/L、BSAl. Og/L的pH 7. 2、0. 02mol/L的磷酸盐缓冲液稀释至浓度为5 μ g/mL ；试剂3 :辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗人MGMT特异性单克隆抗体，使用时以含有O. 05% (w/w)甘油和O. 2g/L的硫柳汞的防腐剂溶液稀释至浓度为2 μ g/mL ;酶标记物形式可为冻干粉、浓缩液和工作液，当标记酶为过氧辣根化物酶，标记方法优选为过氧碘酸钠法；当标记酶为碱性磷酸酶，标记方法优选为戊ニ醛法；试剂4 06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶标准品溶液，溶剂为含有O. 5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7. 2,0. 02mol/L的磷酸盐缓冲液；使用时配制为6个梯度浓度，分别为 600、150、50、25、10、0fmol/mL ；试剂5 :发光底物液，为过氧化氢-鲁米诺发光液或者AMPH)溶液；所述酶标记物的标记酶为过氧辣根化物酶时，发光底物液由A液和B液构成，发光底物液A液为过氧化氢溶液，发光底物液B液为鲁米诺溶液，使用时等体积混合；所述酶标记物的标记酶为碱性磷酸酶时，发光底物液为3- (2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4- (3’ -羟基)苯-1，2-ニ氧杂环丁烧憐酸钠(4_methoxy-4-(3-phosphatephenyl )-spiro-( I, 2-dioxetane_3，2，_admantane)，AMPPD)溶液，溶剂为0. 5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7. 2,0. 02mol/L的磷酸盐缓冲液。试剂6 :浓缩洗涤液，为含有O. 19Γ0. 5% (w/w)吐温_20、0. 1% (w/w)叠氮化钠的磷酸盐缓冲溶液，pH 7. 4。本专利技术提出了使用链亲和素(Streptavidin, SA)修饰磁性微球捕获MGMT,结合酶促化学发光反应来检测MGMT的活性的方法。检测原理图如图I所示(a)待测的MGMT与Biotin标记MGMT底物生物素化O6-苄基鸟嘌呤(Biotin-BG)反应，在苄基转移到酶蛋白后形成生物素标记的MGMT即Biotin-MGMT ； (b)加入过量链霉亲和素修饰的磁性微球P (St-GMA-SA) /Fe3O4俘获Biotin-MGMT，并在外加磁场作用下进行分离；(c)最后加入O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶特异性抗体的酶标记物(ALP-anti-MGMT或HRP-anti-MGMT)；(d)使用酶促化学发光底物来检测MGMT的活性相关指标。由于MGMT能催化Biotin-BG上的苯甲基转移到自身的巯基上，使MGMT标记上了 Biotin，从而形成Biotin-MGMT，可被带有SA配基的P(St-GMA-SA)/Fe3O4捕获。MGMT的活性越高，催化能力就越强，被Biotin标记的量就越高，从而被P (St-GMA-SA) /Fe3O4捕获的量就越多，因此MGMT的活性与被P (St-GMA-SA) /Fe3O4捕获数量直接相关，通过酶促化学发光反应即可获得MGMT的活性信息，最終被检测样品的发光强度度值越高，即被捕获的MGMT数量越多，MGMT的活性就越高。即本专利技术采用高特异性的anti-MGMT和Biotin-BG两种探针，与MGMT形成免疫夹心复合物，结合磁性微球固相分离和酶促化学发光检测技木，从而达到快速、灵敏检测MGMT活性的目的。本专利技术还涉及ー种利用所述的试剂盒对O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性进行检测的方法，所述方法包括(I)按本领域常规方法提取待测样品的总蛋白质；(2)向试管中加入25 μ L上述处理后的样品蛋白质，再加入50 μ L试剂2 (稀释后的)，37°C恒温振荡反应30min，加入50 μ L试剂1，37°C恒温振荡反应5min后，将试管架置 于磁分离器上分离5min，然后倒出上层清夜；往试管中加入500 μ L试剂6 (稀释后的)，充分洗涤2 3次后，置于磁分离器上分离5min，除去上清液，再加入50 μ L试剂3(稀释后的)，37°C恒温振荡反应5min后，将试管架置于磁分离器上分离5min，然后倒出上层清夜，加入500 μ L试剂6 (稀释后的)，充分洗涤2 3次后，置于磁分离器上分离5min，除去上清，加入300 μ L试剂5,充分混勻后,暗处放置2min后置于磁分离器,待所有磁性微球富集于试管底部后，置于化学发光仪測定，获得其发光值；(3)取梯度浓度的试剂4，按照步骤(2)的方法分别测定其发光值，以所获得的每个浓度标准溶液的平均值(RLU)减去浓度为O的标准本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测ο6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的化学发光检测试剂盒，主要包括 试剂I :链霉亲和素磁珠浓度为f5mg/mL的分散液，溶剂为含有O. 5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7. 2、0· 02mol/L的磷酸盐缓冲液； 试剂2 :生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤溶液，使用时以含有叠氮钠O. 2g/L、BSAl. Og/L的pH 7. 2、0. 02mol/L的磷酸盐缓冲液稀释至浓度为5 μ g/mL ； 试剂3 :辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗人MGMT特异性单克隆抗体，使用时以含有O. 05%甘油和O. 2g/L的硫柳汞的防腐剂溶液稀释至浓度为2 μ g/mL ； 试剂4 06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶标准品溶液，溶剂为含有O. 5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7. 2、0· 02mol/L的磷酸盐缓冲液； 试剂5 :发光底物液，为过氧化氢-鲁米诺发光液或者AMPH)溶液； 试剂6 :浓缩洗涤液，为含有O. 19Γ0. 5%吐温-20、0. 1%叠氮化钠的磷酸盐缓冲溶液，pH7. 4，使用时蒸馏水稀释20倍。2.利用如权利要求I所述的试剂盒对O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶进行检测的方法，所述方法包括 (1)提取待测样品的总...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁媛媛，温汉华，何睿，焦艳华，陈灿玉，黄志坚，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：
0来自[未知地区] 2013年03月03日 16:00电话给一个，谢谢！