本发明专利技术涉及分析化学和药物化学领域，公开了延胡索水溶性非生物碱类化合物的分析检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取延胡索水溶性非生物碱类提取物，高速离心后过滤；(2)取(1)的上清液干燥后经三甲基硅烷化衍生化处理；(3)将步骤(2)的衍生化产物用气相色谱质谱联用方法分析。本发明专利技术可简单、快速、准确地检测延胡索中水溶性非生物碱类化合物成分及其含量，对于充分了解传统良药延胡索的化学成分和控制延胡索水溶性提取物的质量有着重要意义，为延胡索的深入开发提供了研究资料，使研究和生产更加安全、有效和质量可控的延胡索新药成为可能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分析化学和药物化学领域，具体为分析检测延胡索水溶性非生物碱类化合物的方法。
技术介绍
中药延胡索是I!粟科紫堇属植物延胡索(Corydalis yanhusuo W. T. Wang)的干燥块莖，性味辛、苦、温，归肝、脾经，具有活血、利气、止痛的功效。主要用于胸胁脘腹疼痛、经闭、痛经、产后瘀阻、跌扑肿痛等。在延胡索的药效部位筛选研究中发现，延胡索的80%乙醇提取物过DA201大孔树脂柱，富集的纯水洗脱部位在药效学试验中表现出好的抗心肌缺血作用(大剂量，350mg/kg)。因此，该部位具有一定的研究价值，已有相关专利授权(公开号CN 101284050A)。该 水洗脱部分的得率占80%乙醇提取物的60%左右，经可见分光光度法测定不含生物碱。相对于研究较充分的生物碱类成分，延胡索中水溶性非生物碱类化合物研究甚少，已见报道的化合物只有香草酸、对羟基苯甲酸、延胡索酸、延胡索多糖等几种，是否含有大极性的醇、酸、单糖和低聚糖类等化合物，以及如何进行分析检测和定性，至今还没有相关研究报道。天然产物中的大极性化合物，具有种类多，极性接近，含量少，大都含有一个或多个羟基，羧基或氨基等特点，此类化合物的研究工作量大，周期长，植物化学工作者一直没有太好的分离纯化办法。虽然有厂家不断推出新的液相制备色谱柱，但由于缺乏相应的液相质谱联用的化合物数据库，使分离，检测和结构确证不能同时很好的解决。气相色谱质谱联用(GC/MS)是一种高效的分析技术，该技术利用气相色谱的分离能力让混合物中的组分分离，并用质谱鉴定分离出来的组分(定性分析)以及其精确的量(定量分析)，气相和质谱控制、数据的记录、分析都由电脑完成。气质联用具有非常高的灵敏度(10_5克)，并且可以分析的范围非常广泛，如药物的分析、环境污染物的分析、食品添加剂的分析、兴奋剂及毒品鉴定等。为了解决挥发性、热稳定性差的化合物在气相色谱中的应用，可以采用衍生化试剂进行衍生化处理，提高化合物的挥发性、热稳定性。常用的衍生试剂有硅烷化试剂、酰基化试剂和烷基化试剂。其中硅烷化衍生化法，特别是三甲基硅烷化在气相色谱分析中用途最大。许多被认为是不具有挥发性的或是在200 300°C热不稳定的含有羟基或氨基的化合物，经过硅烷化后成功的进行色谱分析，通过后者的分析检测可以对目标化合物进行定性和(或)定量分析。但由于天然产物中大极性化合物种类多，采用常规的硅烷化衍生化法虽使衍生物挥发性增强，制备快速、简便，衍生化反应可在室温下几分钟完成，适用于醛糖、酮糖、甙、糖醇、糖醛酸和脱氧糖等的衍生化。但其也存在巨大的缺点由于天然产物中组份众多，各种大小分子化合物、单糖异构体和不同大小环的特殊单糖的存在，造成色谱峰多于组分单糖的数目，从而导致混合物的定性定量分析复杂化，无法有效的完成对天然产物中有效成分的分析，因此目前本法未有在天然产物分析中实际应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种简单、快速准确的方法，对延胡索中的水溶性非生物碱类化合物(即大极性醇，酸，单糖和低聚糖类等化合物)进行检测分析。同时通过本专利技术还可对延胡索中非生物碱类化合物含量进行检测以此监控延胡索药材质量。这是因为，延胡索水溶性非生物碱类化合物中的酸和糖类物质的含量直接影响了延胡索水溶性提取物的抗心肌缺血作用(即总黄酮的药效作用)。在本专利技术研究过程中发现，大分子物质将严重影响气相色谱质谱联用方法的检测结果，因此，在延胡索水溶性非生物碱类化合物含量检测中必须进行前处理，将大分子物质清除干净，去除其对检测结果的影响。本专利技术的具体步骤包括(I)取延胡索水溶性非生物碱类提取物，高速离心后过滤； (2)取(I)的上清液干燥后进行三甲基硅烷化衍生化处理；(3)将步骤(2)的衍生化产物用气相色谱质谱联用方法分析。步骤⑴具体方法为(a)延胡索粉碎后用30wt% 70被％的乙醇溶液提取2 4次，过滤，取滤液；每次乙醇溶液重量为延胡索药材药粉的4 8倍；优选方案为取延胡索药材粗粉，50wt%乙醇溶液提取三次，每次乙醇溶液的用量为延胡索药材粗粉重量的6倍；(b)将滤液浓缩至六分之一到五分之一体积，加入无水乙醇，调节乙醇浓度80wt*% 85wt*%, 8000 12000rpm高速离心4 IOmin后过滤,取滤液；(c)将滤液过大孔树脂柱，并用3 6倍柱体积的纯水洗脱；大孔树脂优选DA201，收集4倍柱体积的纯水洗脱获得的部位。取(c)的水洗脱部位，干燥后进行三甲基硅烷化衍生化处理；三甲基硅烷化衍生化处理的步骤包括将延胡索水溶性非生物碱类提取物与干燥的三甲基硅烷化试剂混合，以吡啶或甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液为催化剂，68 75°C下密闭反应0. 5 I小时；所述三甲基硅烷化试剂为双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷的混合物，两者体积比优选为99 I ；优选方案是称取经氮气吹干的样品于衍生化瓶中，然后加入催化剂吡啶和经氮气吹干的硅烷化试剂(99% BSTFA+1 % TMS)，于70°C恒温水浴中密闭反应I小时，冷却，得三甲基硅烷化反应溶液。收集所得到的衍生化产物，采用气相色谱质谱联用方法分析，气相色谱条件为采用非极性毛细管柱；进样口温度256 262°C ;检测器温度256 262°C ;程序升温初始温度88 92°C，保持3 5分钟，以5. 5 7°C /min的速率升至200 202°C，保持4 6分钟，再以每分钟8 12 °C速率升至246 255°C，保持8 15分钟；载气为高纯氮气、氖气或氦气，载气流速为1.7 2ml/min;分流进样，分流比9 : I 10 : I ;进样量2 5u I ；质谱条件为离子源温度218 225°C，传输杆温度245 254°C，电子轰击能量50 IOOeV ;灯丝电流35 45y A，检测电压2500 3000V。步骤(3)气相色谱条件的一个优选实施方案是非极性毛细管柱；进样口温度260°C;检测器温度260°C;程序升温初始温度90°C，保持4分钟，以每分钟6°C升至200°C，保持5分钟，再以每分钟10°C升至250°C，保持10分钟；载气为高纯氮气，载气流速为每分钟I. 9ml ;分流进样，分流比10 I ;进样量2iil。步骤(3)质谱条件的一个优选实施方案是离子温度220°C，传输杆温度250°C，电子轰击能量70eV，灯丝电流40iiA，检测电压2700V。步骤(3)气相色谱条件的另一个优选实施方案是非极性毛细管柱；进样口温度258 0C ;检测器温度258°C ;程序升温初始温度91°C，保持3. 5分钟，以每分钟6. 5°C升至202°C，保持6分钟，再以每分钟9°C速率升至252°C，保持12分钟；载气为高纯氮气，载气流速为每分钟2ml;分流进样，分流比10 I;进样量2iU。、步骤(3)质谱条件的另一个优选实施方案是离子源温度222°C，传输杆温度、252°C，电子轰击能量80eV，灯丝电流40y A，检测电压2700V。根据本专利技术，可以检测出约50多种延胡索中水溶性非生物碱类化合物。按照色谱峰面积归一化法计算，实施例4 9中磷酸、D-吡喃葡萄糖、环己六醇、乳糖的含量如表I所/Jn o表I实施例4 9中磷酸、D-吡喃葡萄糖、环己六醇、乳糖的含量本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.延胡索水溶性非生物碱类化合物的分析检测方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)取延胡索水溶性非生物碱类提取物，高速离心后过滤； (2)取(I)的上清液干燥后进行三甲基硅烷化衍生化处理； (3)将步骤(2)的衍生化产物用气相色谱质谱联用方法分析。2.权利要求I所述延胡索水溶性非生物碱类化合物的分析检测方法，其特征在于，所述延胡索水溶性非生物碱类提取物的制备方法为，延胡索粉碎后用30Wt% 70Wt%乙醇溶液提取，过滤，滤液浓缩至六分之一到五分之一体积，加入无水乙醇，调节乙醇浓度至80wt% SSwtl^jOOO 12000rpm高速离心4 IOmin后过滤,取滤液过大孔树脂柱，并用纯水洗脱。3.权利要求2所述延胡索水溶性非生物碱类化合物的分析检测方法，其特征在于，用3 6倍柱体积纯水洗脱。4.权利要求I所述延胡索水溶性非生物碱类化合物的分析检测方法，其特征在于，步骤(2)所述三甲基硅烷化衍生化处理的步骤包括将干燥的延胡索水溶性非生物碱类提取物和干燥的三甲基硅烷化试剂混合，以吡啶或甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液为催化剂，68 75°C下密闭反应O. 5 I小时。5.权利要求I所述延胡索水溶性非生物碱类化合物的分析检测方法，其特征在于，所述三甲基硅烷化试剂为双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷的混合物。6.权利要求I所述延胡索水溶性非生物碱类化合物的分析检测方法，其特征在于，步骤(3)所述气相色谱质谱联用方法分析，气相色谱条件为采用非极性毛细管柱；进样口温度256 262°C;检测器温度256 262°C;程序升温初始温度88 92°C，保持3 5分钟，以5. 5 7V /min的速率升至200 202°C，保持4 6分钟，再以每分钟8 12°C速率升至246 255°C，保持...
【专利技术属性】
技术研发人员：王如伟，刘振华，章江生，叶剑锋，方玲，胡江宁，
申请(专利权)人：浙江康恩贝制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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