一种F蛋白检测试剂及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种F蛋白检测试剂，包括F蛋白的兔抗人多克隆抗体、酶标抗体、显色试剂和终止液，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标抗体，所述显色试剂为A液(含0.01％H2O2)和B液(pH?7.4，含0.4mg/ml?TMB(3，3，5，5-四甲基连苯胺)的0.1mol/L枸椽酸缓冲液)；所述终止液为2M的硫酸水溶液。本发明专利技术根据F蛋白在肝脏组织受到损伤后从肝细胞大量释放到血液循环中，可诱导机体产生特异性的细胞和体液免疫应答，采用基因工程制备并经Ni2+柱层析高度纯化后的HIS-F蛋白提高了诊断的精确度和诊断效率，节约了检测成本，使其在临床应用方面具有重大的理论意义和潜在的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术专利属于生物医学工程和医学检验
，尤其是指一种F蛋白检测试剂及检测方法。
技术介绍
在生物医学工程关于细胞的科研领 域及医学临床应用中，F蛋白是一种特异存在于肝细胞中的蛋白质，只有当肝实质受损方释放入血液中，因此现代医学认为F蛋白是一种特异的肝细胞损害标志物。肝病的诊断一直是医学诊断学中一个重要的组成部分，肝脏F蛋白作为一种可直接反映肝损伤程度的血清学标志，其血清含量与各种原因造成的肝损伤程度成正相关。无论何种原因导致的肝病，均表现为肝细胞损害，血清中F抗原均可升高。血清F抗原的含量变化与肝组织学改变有密切的相关性。血清F抗原为肝脏特有，敏感性非常高，正常人血清F抗原浓度无年龄、性别差异，肝细胞受损时血液中出现的时间早，而且是不可诱导的，因此，血清F抗原是一种新的比常规肝功能项目更灵敏而特异的指标。如果制成F蛋白的免疫试剂，其将在肝病早期诊断与治疗、药物的筛选与疗效观察、肝病预后的判断等方面发挥重要作用。目前国内外获得F蛋白比较困难且缺乏统一的标准，难以相互验证，不利于研究工作的深入；国内外有学者通过提纯的方法提取F蛋白，利用这种方法很难得到大量且较纯的F蛋白；迄今为止用基因克隆的方法获得F蛋白的基因序列只有在大鼠中获得F蛋白克隆的报道，未见人肝脏F蛋白的克隆和表达的文献报道，同时Genebank上亦没有相应的序列发布。在查阅大量国内外相关文献基础上，我们参照与人类同源性较高的大鼠肝脏F蛋白的基因序列先后设计了 10对不同的上下游引物，成功扩增出人肝脏F蛋白基因序列。我们将人类肝脏F蛋白的基因序列在NCBI的GENEBANK上发布(序列号DQ188836)，并对此序列进行了 Blast比对，结果显示，人类肝脏F蛋白的基因序列与大鼠肝脏F蛋白的基因序列的同源性高达99%。进而利用已获得的F蛋白的cDNA在原核载体(大肠杆菌BL21 (DE3)PLysS)表达出F蛋白，使F蛋白的大量制备成为可能，解决其来源问题；通过改进提纯的方法一方面得到人肝脏F蛋白的提纯品，另一方面将提纯的F蛋白与克隆表达的F蛋白通过免疫特性相互验证；同时制备其多克隆抗体和单克隆抗体，并通过多克隆抗体检测部分临床标本，来初步验证F蛋白作为一种临床诊断试剂的可打性，为使F蛋白的研究尽快地从实验室走向临床奠定更坚实的基础。在众多的免疫测定技术中，酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbentassay, ELISA)应用最为广泛，最具代表性。ELISA是60年代末，在酶免疫组织化学的基础上由Engvall和Perlmann以及Van Weeman和Schuurs等发展的一种酶标固相免疫测定技术。这种简单方便的免疫测定技术出现后，不但成为了一种非常简便的研究工具，而且迅速地应用于各种生物活性物质及标志物的临床检测，并在临床应用中逐渐取代了有环境污染、废液难以处理等缺点的放射免疫试验。免疫测定的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，而ELISA顾名思义就是以酶作为标记物、以抗原抗体免疫反应为基础的固相吸附测定方法。ELISA的测定试剂的有机组成部分包括三个方面，即固相支持物及包被的抗原或抗体、酶标记的抗体或抗原和酶反应底物等。抗原或抗体的固相化并不影响其免疫结合活性，酶标记的抗原或抗体亦是如此，并且标记酶的活性不因标记过程而丧失。整个测定中，抗原抗体结合反应在固相支持物上进行，反应结果的判断以酶与其底物作用后的显色或产生的荧光或发光反应为准则，显色或产生荧光的强度与临床标本中待测物的浓度成正比或反比关系。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，近年来随着分子生物学技术的发展，使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂已成为现实，各种新型实用的测定方法不断出现，进一步拓宽了免疫测定技术的发展途径。现在基因工程抗原在ELISA方法中的应用得到了极大的拓展，有逐渐取代人工提纯抗原的趋势。最早是在HIV抗体免疫测定中所使用的抗原为用去垢剂裂解HIV感染的细胞后所提取的病毒抗原，这样得到的抗原纯度相对较差，因此影响测定的特异性和敏感性。现在国内外用于HIV抗体检测的ELISA试剂盒均使用基因工程抗原如gp41，gp 120及gp 160等，大大提高了测定的特异性和敏感性。HCV目前尚不能体外培养，只能用基因工程或化学合成的方法获得HCV结构区和非结构区的各种抗原片段。已知HCV基因组由7个功能区组 成；核心、E1、E2/NS1、NS2、NS3、NS4和NS5区。最近，美国Chiron公司Chien等研制了一种包括HCV基因组7个功能区所有免疫决定基的单一融合蛋白，称为多表位融合抗原_6。使用该融合蛋白建立的化学发光免疫测定方法，其测定敏感性较使用由NS3-NS4核心(C25)区组成的融合蛋白所建立的酶免疫测定方法要高2-4倍。此外，近年来不少研究者采用基因工程技术重组表达了梅毒螺旋体的具有高度免疫原性的膜脂蛋白TpN17、TpN44. 5 (TmpA)和TpN47等，用其建立梅毒抗体检测的ELISA方法，表现了很好的测定特异性和敏感性，将成为取你快速血浆反应素环状片试验(Rapidplasma reagin circle card test, RPR)和螺旋体血球凝集试验(Treponemal pallidumhemagglutination assay, TPHA)的梅毒抗体理想的检测方法。由上述可见，基因工程抗原对建立高灵敏高特异的免疫测定方法具有不可替代的作用，已成为难以培养的病原体抗原的最佳来源，亦解决了病原体裂解提取抗原纯度差的问题。综观未来，基因工程抗原在免疫测定中的应用，有其独特的魅力和广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种既方便、快捷，又安全、经济的检测各种肝病及肝细胞损伤的F蛋白检测试剂及检测方法，填补国内在这一检测领域的空白。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的一种F蛋白检测试剂，包括F蛋白的兔抗人多克隆抗体、酶标抗体、显色试剂和终止液。而且，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标抗体。而且，所述显色试剂为含O. 01% H2O2的水溶液和pH 7. 4，含O. 4mg/ml TMB (3, 3,5，5-四甲基连苯胺)的O. lmol/L枸椽酸缓冲液。而且，所述终止液味2M的硫酸水溶液。而且，还包括缓冲液和洗涤液。而且，所述包括缓冲液为PBS O. 01M, pH 7. 4 ;所述洗涤液为PBST，配置方法为10XTBS pH 7.6 :Tris_ 碱，60. 57g ；1M HCl, 420ml ;NaCl，85_90g，用 HCl 调 pH 至 7· 6 后，定容于IL ；1XTBST :将10XTBS稀释10倍，同时加入O. I %的TWEEN-20。利用F蛋白检测试剂检测F蛋白含量的方法，其特征在于步骤如下(I)包被使用纯化的F蛋白多克隆抗体按10 μ g/ml蛋白量进行包被，100 μ I/孔，4°C过夜，O. OlM PBS pH 7. 4洗涤三次，含I %胎牛血清的PBS封闭，110 μ I/孔，37°C I小时，弃包被液待用；(2)取包被有F蛋白多克隆抗体的96孔板，加入待测血清50 μ I/孔，然后酶标抗、体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种F蛋白检测试剂，其特征在于包括F蛋白的兔抗人多克隆抗体、酶标抗体、显色试剂和终止液。2.根据权利要求I所述的F蛋白检测试剂，其特征在于所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标抗体。3.根据权利要求I所述的F蛋白检测试剂，其特征在于所述显色试剂为含O.Ol 1^H2O2的水溶液和PH 7. 4含O. 4mg/ml TMB的O. Imo 1/L枸椽酸缓冲液。4.根据权利要求I所述的F蛋白检测试剂，其特征在于所述终止液为2M的硫酸水溶液。5.根据权利要求I所述的F蛋白检测试剂，其特征在于还包括缓冲液和洗涤液。6.根据权利要求5所述的F蛋白检测试剂，其特征在于所述包括缓冲液为PBSO. 01M, pH 7. 4;所述洗涤液为 PBST，配置方法为10XTBSpH 7. 6 :Tris_ 碱，60. 57g ;IMHCl，420ml ;NaCl, 85_90g,用 HCl 调 pH 至 7· 6 后，定容于 IL ；1 XTBST :将 10XTBS 稀释 10倍，加入 O. 1% (v/v)的 TWEEN-20。7.利用权利要求1-6之一所述的F蛋白检测试剂检测F蛋白含量的方法，其特征在于步骤如下 (1)包被使用纯化的F蛋白多克隆抗体按10μ g/ml蛋白量进行包被，100 μ I/孔，4°C过夜，O. OlM PBS pH 7. 4洗涤三次，含I %胎牛血清的PBS封闭，110 μ I/孔，37°C I小时，弃包被液待用； (2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘树业，任峰，
申请(专利权)人：天津美德太平洋科技有限公司，
类型：发明
国别省市：