本发明专利技术公开一种前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒及其检测方法。其包括均相发光96孔测定板，前列腺特异抗原标准品，链霉亲和素标记供体微球溶液；该试剂盒还包括生物素标记抗前列腺特异抗原抗体和抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球溶液。检测时，测定板内依次加入待测样本、生物素标记抗体、特异性抗体包被受体微球，混匀后温育，加入链霉亲和素标记供体微球，继续温育；均相发光免疫分析仪测定各孔发光强度，四参数拟合方式绘制标准曲线，计算待测样品前列腺特异抗原浓度。成为混合后即测定模式，测定过程没有洗涤步骤。集酶免疫分析和电化学发光免疫分析之优点，成本低，适合基层医院推广应用，高通量适合用于大样本的筛查。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及光激发偶联免疫检测技术，具体是一种。
技术介绍
1971年，Hara等人首先发现前列腺特异抗原(prostate specific antigen ,PSA)，它由前列腺上皮细胞合成并分泌至精液中，是精浆的主要成分之一。前列腺特异抗原具有器官特异性，仅存在于前列腺上皮细胞、导管上皮细胞的胞质和黏液内，具有糜蛋白酶样和胰蛋白酶的活性。正常情况下，前列腺腺泡与淋巴系统之间存在由内皮层、基细胞层和基底膜构成的屏障相隔，外周血中不会出现前列腺特异抗原。当发生肿瘤或其它病变时，破坏前列腺和淋巴系统组织间屏障，富含前列腺特异抗原的腺泡内容物漏入淋巴系统，并相 继进入血液循环，使外周血中前列腺特异抗原升高。前列腺特异抗原是目前公认的唯一具有器官特异性的血清肿瘤标志物。血清前列腺特异抗原升高一般提示前列腺存在病变(前列腺炎、良性前列腺增生、前列腺癌)。检测血清或血浆前列腺特异抗原含量，不仅可在高危人群中早期发现前列腺癌，同时也可用于前列腺癌患者治疗后的监控、手术治疗效果评估等方面。前列腺特异抗原具有良好的免疫原性，能制备特异性抗体并通过免疫化学原理进行测定。标记免疫分析根据标记物不同分为放射免疫分析、酶免疫分析和发光免疫分析，血 清前列腺特异抗原主要采用酶免疫分析和电化学发光免疫分析。无论采用何种分析方式，其检测原理基本相同，即采用双抗体夹心法测定未知前列腺特异抗原将其中一种抗体与固相载体连接作为捕获抗体，用于捕获待测标本中前列腺特异抗原；将另一种抗体与示踪物质(辣根过氧化物酶或三联吡啶钌)结合作为标记(检测)抗体，当标记抗体与前列腺特异抗原结合后，在固相载体表面形成捕获抗体-待测抗原-标记抗体复合物。将固相载体洗漆,去除过剩标记物或未参加反应的成分；酶免疫分析通过加入底物，通过酶促反应强度，对未知抗原进行定量分析。而电化学发光再加入三丙胺与电极表面发生氧化还原反应，通过光信号对未知抗原进行定量分析。酶免疫分析检测前列腺特异抗原的主要优势表现在检测试剂已实现国产化、酶标仪普及程度高；因此，酶免疫分析具有较低检测成本，能够在基层医院开展工作。但是，由于采用辣根过氧化物酶作为示踪物质，稳定性较差且酶活性干扰因素较多，导致酶免疫分析的精密度不够理想。此外，酶免疫分析采用微孔反应板作为固相材料，由于包被抗体的限制，不能实现理想检测范围。电化学发光免疫分析是目前检测性能较高标记免疫分析技术，具有较高的自动化水平，较高的检测性能(敏感度、精密度、稳定性等方面)。但是，电化学发光检测仪昂贵，检测试剂依赖进口，从而使检测成本很高，且基础医疗单位很难开展。基于上述原因，酶免疫分析法主要用于前列腺癌高危人群的筛查，而电化学发光免疫分析主要用于前列腺癌患者确诊和手术治疗效果评估以及监测肿瘤复发等方面。在标记免疫分析中，由于标记抗体(或抗原)在反应体系中是过量的，反应达到平衡后，体系中仍存在剩余的、未结合抗原的标记抗体。其中，非均相免疫分析采用固相吸附法分离结合标记物和游离标记物。固相吸附分离法是将抗原(抗体)吸附在固相载体表面，使免疫反应在固相载体表面上进行，待测物质(抗体或抗原)、标记抗体(抗原)均可通过免疫反应结合在固相材料表面，未结合物质(含游离标记物)存在于液相中。此时，弃去液相并经洗涤，便可去除游离标记物。酶联免疫分析和电化学发光免疫分析检测血清中前列腺特异抗原，两种检测方法的从检测原理上均属于非均相免疫分析，酶免疫分析采用酶联免疫反应板作为固相材料，电化学发光免疫分析采用磁性微球作为固相材料。固相吸附分离方法有两个重要环节包被和洗涤。固相吸附分离方法设计巧妙，操作简单，故应用非常广泛。但是，此种非均相反应模式因包被和洗涤环节的存在，给标记免疫分析造成很大缺陷，主要表现在以下两个方面 I.在包被过程，无论物理吸附还是化学连接，包被后固相材料表面的抗体分子其构象不同于处于液相中的抗体分子，与抗原分子结合能力因空间位阻效应将受到一定限制；无论采用微球还是微孔板作为固相材料，由于包被面积有限，捕获抗体分子不能最大限度满足大量待测抗原的需要，由此将影响检测范围。2. “洗板”或“洗球”是非均相免疫分析中的重要环节且多次出现。洗涤过程增加检测程序的复杂性，增加检测时间并给实现自动化带来障碍。此外，由于洗涤过程特别是酶免疫分析，难于实现标准化，每个测试孔之间洗涤效果不同，在一定程度上影响检测的精密度，出现批间、批内差异。总之，就血清前列腺特异抗原检测项目而言，无论是采用酶免疫分析还是采用电化学发光免疫分析，二者均存在一些方法学上的缺陷。有的操作烦琐，有的实验条件要求过高；有的检验时间太长，有的耗材费用过高。这些不足之处不仅给患者增加就医成本，同时也限制该检测项目的普及应用，影响基层医疗单位的诊疗工作开展。
技术实现思路
本专利技术是为了解决的现有技术存在的上述问题，而提供一种对血清前列腺特异抗原含量能够进行方便、快速和准确检测的基于光激发偶联免疫分析原理的。本专利技术是按以下技术方案实现的。一种前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒，主要包括均相发光96孔测定板，前列腺特异抗原标准品，链霉亲和素标记供体微球溶液，而该试剂盒还包括有生物素标记抗前列腺特异抗原抗体，抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球溶液。所述前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒，其抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球溶液是按以下配比的原料制备的， a.将欲标记的抗前列腺特异抗原抗体置于0.IM pH 8.0磷酸盐缓冲液透析，调整浓度至1_2晕克/晕升备用； b.受体微球加入到0.IM pH 8.0磷酸盐缓冲盐水溶液中，离心16000转/分洗涤微球，弃上清用上述溶液将微球浓度调整至10-20毫克/毫升； c.按受体微球透析后抗前列腺特异抗原抗体为1:10的质量比混合于0.IM pH 8.0磷酸盐缓冲盐水溶液中，依次加入体积百分比为0. 6-0. 625%的10%吐温20溶液、4_5%新鲜配制的400 mM氰基硼氢化钠溶液，充分混匀，37°C反应48小时以上； d.用800mM氢氧化钠溶液配制溶度为65毫克/毫升的羧甲氨基胺溶液，加体积百分比为5%的羧甲氨基胺溶液于标记后的离心管内，37°C封闭反应I小时； e.吸取上清溶液，再加入pH8. 0的IOOmM Tris-HCl溶液，重新悬浮微球、离心洗球，最终调整浓度至5-10微克/毫升备用。所述前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒，其生物素标记抗前列腺特异抗原抗体是按以下配比的原料制备的， a.将纯化的抗前列腺特异抗原抗体调整为5.0毫克/毫升，用0. 1M，pH9. 5的碳酸盐缓冲液透析，过夜并于A28tol计算抗体总量为5. 35毫克； b.将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素与纯化的抗前列腺特异抗原抗体的摩尔比为20:1的比例将二者混合，反应I小时； c.将反应后的液体用0.OlM磷酸盐缓冲盐水于4°C透析24小时，即制成生物素标记抗前列腺特异抗原抗体。 一种前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测方法，其是按以下步骤进行的， a.将分别瓶装的生物素标记抗前列腺特异抗原抗体、前列腺特异抗原标准品、抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球溶液、链霉亲和素标记供体微球溶液取出，至室温平衡20本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒，主要包括均相发光96孔测定板，前列腺特异抗原标准品，链霉亲和素标记供体微球溶液，其特征在于该试剂盒还包括有生物素标记抗前列腺特异抗原抗体和抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球溶液。2.根据权利要求I所述前列腺特异抗原均相发光免疫分析检测试剂盒，其特征在于 抗前列腺特异抗原抗体包被受体微球溶液是按以下配比的原料制备的， a.将欲标记的抗前列腺特异抗原抗体置于0.IM pH 8.0磷酸盐缓冲液透析，调整浓度至1_2晕克/晕升备用； b.受体微球加入到0.IM pH 8.0磷酸盐缓冲盐水溶液中，离心16000转/分洗涤微球，弃上清，用上述溶液将微球浓度调整至10-20毫克/毫升； c.按受体微球透析后抗前列腺特异抗原抗体为1:10的质量比混合，于0.IM pH 8. 0磷酸盐缓冲盐水溶液中，依次加入体积百分比为0. 6-0. 625%的10%吐温20溶液、4_5%新鲜配制的400 mM氰基硼氢化钠溶液，充分混匀，37°C反应48小时以上； d.用800mM氢氧化钠溶液配制溶度为65毫克/毫升的羧甲氨基胺溶液，加体积百分比为4-5%的羧甲氨基胺溶液于标记后的离心管内，37°C封闭反应I小时； e.吸取上清溶液，再加入pH8. 0的IOOmM Tris-HCl溶液，重新悬浮微球、离心洗球，最终调整浓度至5-10微克/毫升备用。3.根据权利要求I所述前列腺特异抗原均相发光免疫...
【专利技术属性】
技术研发人员：李会强，王辰，蔡刚强，邵新华，于学林，刘志永，靳宝英，李婵，
申请(专利权)人：沃克天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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