利用微生物转化制备睾内酯的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用微生物转化制备睾内酯的方法，主要内容包括：将去氢表雄酮溶于增溶剂，加入到转化溶液制取转化底物溶液；将转化底物溶液置入转化反应设备，加入尖孢镰刀菌，在尖孢镰刀菌静息细胞转化作用下，通过Baeyer-Villiger氧化反应，转化为中间产物3β-羟基-17α-氧代-D-扩环-雄甾-5-烯-17-酮，转化反应结束后再加入戈登氏菌，在戈登氏菌静息细胞作用下，中间产物转化反应为睾内酯。本发明专利技术制备睾内酯的方法，具有工艺路线简便，原料易得，辅料价格低廉，底物转化率高，副产物少，生产成本低等优点，克服了原有生产工艺的不足，可工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用微生物转化法将脱氢表雄酮制备成留体原料药睾内酯的方法，属于生物

技术介绍
睾内酯0^如1&(^01^，17 0-氧代-0-扩环-雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮)，也称去氢睾内酯，是一种内源性的留体芳香酶抑制剂，能非竞争性地结合芳香酶，因而能有效地抑制雄激素转化为雌激素。睾内酯通常作为抗肿瘤药物使用，在临床上，主要用于治疗绝经后妇女某些类型的乳腺癌，此外，还可用于治疗女孩性早熟和男性特发性少精子症。通过化学合成法和微生物转化法均可制备睾内酯。由于化学合成法采用的氧化剂有毒、易爆，对环境污染大(Zinczuk J. et al. An Efficient and EnvironmentallyBenign Chemical Synthesis of Testolactone, J. Braz. Chem. Soc. , Vol. 14,970-974, 2003),而微生物转化法制备睾内酯条件温和，又具有环境友好性，因而具有更大的应用前景。专利文献U. S Pat. No. 283171描述了以镰刀菌(Fusarium)为菌种转化黄体酮及其衍生物制备睾内酯，其底物投料浓度为0. 5g/l ;专利文献U. SPat. No. 292666描述了以镰刀菌Fusariumsolani为菌种转化雄烯二酮为睾内酯，转化率为85% ;专利文献G. B. Patent No. 1220829描述了以镰刀菌(Fusarium sp.)为菌种，以双烯醇酮醋酸酯和16-妊娠双烯醇酮为底物，其底物投料浓度仅为0. 5g/l。制备睾内酯的关键步骤是通过Baeyer-Villiger氧化反应使甾体化合物的D环转变形成内酯环，然后在A环的1，2位引入双键。尽管已有上述研究，并取得了相应的研究成果，但微生物转化法制备内睾酯存在副产物多的不足，仍需要探索利用不同菌种转化不同底物制备睾内酯的研究，从而提高投料浓度和转化率，以进一步降低生产成本，同时减少对环境的污染。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有微生物转化制备睾内酯过程中存在的转化效率低、副产物较多等不足，旨在提供一种利用微生物转化制备内睾酯的新方法，以降低生产成本，同时减少对环境的污染。本专利技术的专利技术人对转化所使用的微生物种类、起始化合物、转化条件等进行了长期研究，获得了简便的制备睾内酯的生物工艺路线。本专利技术的基本内容是选择去氢表雄酮作为起始物，以尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和戈登氏菌为转化菌种,采用静息细胞转化法，分两个阶段将底物去氢表雄酮转化为睾内酯。本专利技术公开的，主要包括以下步骤(I)转化底物溶液配制将起始底物去氢表雄酮溶于增溶剂，经超声波处理后加入到转化溶液，制得转化底物溶液；(2) 一次转化步骤(I)制取的转化底物溶液置入转化反应设备，加入尖孢镰刀菌静息细胞，通过Baeyer-Villiger氧化反应,起始底物去氢表雄酮转化为中间产物3 β -轻基-17 α -氧代-D-扩环-雄甾-5-烯-17-酮；(3) 二次转化一次转化反应结束后加入戈登氏菌，中间产物3 β -羟基-17 α -氧代-D-扩环-雄留-5-烯-17-酮在戈登氏菌静息细胞作用下转化反应为睾内酯。在上述技术方案中，所述转化溶液可选自pH为5. 8 6. 6的磷酸缓冲液和无菌水。转化溶液最好加入一定量的体积浓度为O. 05 O. 15%的吐温-80，能更有利于转化反应。其中作为转化溶液的磷酸缓冲液可由O. 15 O. 25mol/L的NaH2PO4溶液和O. 15 O. 25mol/L的Na2HPO4溶液按体积比(73. 5 92. O) (26. 5 8. O)的比例配制。在上述技术方案中，所述增溶剂选自体积浓度为O. 05 O. 15%的吐温-80、乙醇、甲醇和丙酮，优先选用吐温-80。在上述技术方案中，步骤(2)所进行的一次转化，最好是于26 32°C、200 250rpm和有氧条件下进行转化反应，且转化反应最好进行至稀硫酸显色的硅胶薄板上看不到底物条带时结束。在上述技术方案中，步骤(3)所进行的二次转化，最好是于28 37°C、200 250rpm和有氧条件下进行转化反应，且转化反应至稀硫酸显色的硅胶薄板上看不到中间产物条带时结束。在二次转化反应过程中，为了取得更好的技术效果可加入羟基化酶抑制剂。羟基化酶抑制剂可选自2，2，-联吡啶和8-羟喹啉。在上述技术方案中，步骤(2)进行的一次转化反应和步骤(3)进行的二次转化反应，最好在同一制备容器中进行，即在底物经尖孢镰刀菌静息细胞转化结束后，直接在转化液中加入戈登氏菌细胞，进行第二次转化，且第一次转化反应的细胞残留物对第二次的转化无任何影响。在上述技术方案中，尖孢镰刀菌菌株优先选用尖孢镰刀菌ATCC 10960或ATCC16416。戈登氏菌菌株优先选用戈登氏菌Gordonia neofelifaecis。戈登氏菌静息细胞最好先在含固醇的培养液中诱导培养。本专利技术公开的，在利用尖孢镰刀菌将底物去氢表雄酮转化为中间产物3 β -羟基-17 α -氧代-D-扩环-雄留-5-烯_17_酮的过程，反应体系中细胞浓度(湿细胞)可在20-70g/L范围之间调整；在利用戈登氏菌将中间产物3 β -羟基-17 α -氧代-D-扩环-雄甾-5-烯_17_酮转化为睾内酯的过程，反应体系中细胞浓度(湿细胞)可在20-100g/L范围之间调整。本专利技术第一次转化所采用的尖孢镰刀菌，其细胞的培养过程如下在固体培养基(土豆20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH 6. 0-6. 5)上接种镰刀菌孢子，28_30°C培养5-7天，用无菌水洗下孢子，灭菌纱布过滤，制成孢子悬液，孢子浓度为IO7个/mL，4°C下保存待用，一般此条件下可保存10天以内，不影响活性。以5%的接种量取浓度为I X IO7个/ml孢子悬液接种于液体培养基(O. 5%黄豆粉，O. 5%酵母浸出粉，2%葡萄糖，O. 5% NaCl, O. 5%K2HPO4, pH = 6. 0-6. 5)中，200rpm，28-30°C培养3天，离心收集细胞，即为用于转化的静息细胞。用于增殖尖孢镰刀菌细胞培养的材料不限于以上所述种类，玉米浆、牛肉膏、鱼粉均等均可作为增殖尖孢镰刀菌细胞培养基的氮源和碳源；其中可作为培养基碳源的材料包括蔗糖、淀粉、糖蜜、甘油等。增殖细胞的培养体积，可以根据实验情况加以增减，可以对其种子进行二级甚至三级培养，以得到更多的静息细胞。第二次转化反应所采用的戈登氏菌，其细胞的培养过程如下在液体培养基中增殖戈登氏菌，接种一环戈登氏菌于液体培养基(酵母粉0.5%，固醇O. 1%，吐温-80 O. 1%,NH4NO3 O. 1%, KH2PO4 O. 02% 5, MgSO4 · 7H20 O. 025%, FeSO4 O. 0001%, pH 7. O)中，30。。，200rpm振荡培养24小时，离心收集细胞，用磷酸盐缓冲液清洗一次，即为戈登氏菌静息细胞。用于戈登氏菌细胞的培养材料不限于以上所述种类，同样如前所述，可进行调整。具有活性的戈登氏菌静息细胞需要在含固醇的培养基中诱导培养。其中固醇选自胆固醇、谷甾醇、豆留醇、菜油留醇等。本专利技术公开的，睾内酯的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用微生物转化制备睾内酯的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)转化底物溶液配制将起始底物去氢表雄酮溶于增溶剂，经超声波处理，加入到转化溶液，制得转化底物溶液； (2)一次转化步骤(I)制取的转化底物溶液置入转化反应设备，加入尖孢镰刀菌静息细胞，通过Baeyer-Villiger氧化反应,起始底物去氢表雄酮转化为中间产物3 0 -轻基-17 a -氧代-D-扩环-雄甾-5-烯-17-酮； (3)二次转化一次转化反应结束后加入戈登氏菌静息细胞进行转化反应，中间产物3 3 -羟基-17 a -氧代-D-扩环-雄甾-5-烯-17-酮在戈登氏菌静息细胞作用下转化反应为睾内酯。2.根据权利要求I所述的利用微生物转化制备睾内酯的方法，其特征在于所述转化溶液选自pH为5. 8 6. 6的磷酸缓冲液和无菌水。3.根据权利要求2所述的利用微生物转化制备睾内酯的方法，其特征在于所述转化溶液加入有体积浓度为0. 05 0. 15%的吐温-80。4.根据权利要求3所述的利用微生物转化制备睾内酯的方法，其特征在于作为转化溶液的磷酸缓冲液由0. 15 0. 25mol/L的NaH2PO4溶液和0. 15 0. 25mol/L的Na2HPO4溶液按体积比(73. 5 92. 0) (...

【专利技术属性】
技术研发人员：李维，葛方兰，陈贵英，张光祥，
申请(专利权)人：四川师范大学，
类型：发明
国别省市：