大竹蛏丝氨酸蛋白酶抑制剂SgKunitz基因及其重组蛋白和应用制造技术

本发明专利技术是大竹蛏Kunitz型蛋白酶抑制剂基因SgKunitz的克隆和体外重组表达技术，本发明专利技术利用构建的大竹蛏cDNA文库，克隆得到了大竹蛏Kunitz型蛋白酶抑制剂基因SgKunitz的cDNA全长序列，该基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示；利用原核重组表达技术表达了其编码蛋白，该重组蛋白对于胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性具有较强的抑制作用。该基因及其重组蛋白的研究对于进一步了解Kunitz型蛋白酶抑制剂基因在先天性免疫中发挥的功能，研制新的人类疾病防治药物和动物饲料添加剂具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，具体讲是从大竹蛏cDNA文库中获得大竹蛏丝氨酸蛋白酶抑制剂SgKunitz基因的全长cDNA序列，并对其Kunitz结构域进行了原核重组表达；涉及到该重组产物对胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的抑制作用；以及该重组产物作为蛋白酶抑制剂在人类疾病治疗和动物饲料添加中的潜在应用。
技术介绍
无脊椎动物依赖先天性免疫抵御病原的侵袭，維持正常的生命活动。从病原微生物侵袭到清除病原一般要经过以下几个步骤首先无脊椎动物识别外来异物；随后，非己识别信号引发了信号级联反应，比如激活丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂介导的细胞外级联反应，将信号放大或解除错误警报；然后激活相应的信号转导途径，产生各种目的基因的转录活性；最后，激活细胞和效应物反应系统杀死和清除病原体。胰蛋白酶家族的 丝氨酸蛋白酶及其抑制因子在无脊椎动物的免疫应答中起着核心作用，它们的协同作用与信号转导和级联放大有夫，并导致先天性的免疫防御系统的激活和抗菌肽的合成。丝氨酸蛋白酶抑制剂作为ー种重要的免疫因子，通过与靶酶相互结合形成稳定的复合体，防止生物体内丝氨酸蛋白酶的有害水解激活，调节体内蛋白酶级联反应。目前已发现数百种丝氨酸蛋白酶抑制剂，它们被划分为十几个家族，动物体内的丝氨酸蛋白酶抑制剂主要分布在Kunitz、Kazal、Serpin和α-巨球蛋白四个家族。其中，Kunitz型蛋白酶抑制剂含有一个或多个由约60个氨基酸残基编码的Kunitz结构域，该结构是其主要功能区，主要对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶有抑制作用。Kunitz型蛋白酶抑制剂通过调节丝氨酸蛋白酶活性參与免疫信号传导途径，在抵御病原入侵过程中发挥重要作用。近年来，在海洋动物中发现多种丝氨酸蛋白酶抑制剂，如kazal和serpin型蛋白酶抑制剂。但是,对于海洋动物Kunitz型蛋白酶抑制剂及其免疫功能的研究十分有限，未见关于大竹蛏Kunitz型蛋白酶抑制剂的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是要填补有关大竹蛏Kunitz型蛋白酶抑制剂研究的空白，克隆大竹蛏Kunitz型蛋白酶抑制剂基因，对其结构域进行蛋白重组，分析重组蛋白的活性，为阐明大竹蛏免疫级联反应机制，深入了解无脊椎动物先天性免疫，开发天然的海洋药物和饲料添加剂奠定基础。本专利技术的目的是由以下技术方案实现的克隆得到了ー种大竹蛏Kunitz型蛋白酶抑制剂基因，该基因具有SEQ ID No. I中的核苷酸序列，该序列全长1284bp，5’非编码区52bp，3’非编码区464bp，有多聚腺苷酸尾巴，开放阅读框768bp，编码255个氨基酸；氨基酸序列如SEQ ID No. 2中所示，其中1-17个氨基酸为信号肽序列，成熟肽分子量为28. 6kDa，等电点为8. 13 ;具有4个Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构域，每个结构域有2个α螺旋结构和2个β折叠结构，还有6个半胱氨酸形成3对ニ硫键。该重组蛋白与胰蛋白酶和糜蛋白酶以质量比1:1比例混合时，能够分别抑制57. 2%和43. 1%的胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，在与胰蛋白酶和糜蛋白酶以质量比4:1比例混合吋，能分别抑制75. 9%和56. 9%的胰蛋白酶和糜蛋白酶活性。一种克隆大竹蛏Kunitz型蛋白酶抑制剂基因并制备其重组蛋白的方法，所述的方法是从构建的大竹蛏cDNA文库，利用现代分子生物学技术分析得到了 Kunitz型蛋白酶抑制剂的EST序列，将对应的质粒转化后测序得到基因cDNA全长，以原核表达的方法构建其重组质粒，诱导后纯化得到重组蛋白，重组蛋白经过复性，检测其对胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的抑制作用。本专利技术的优点克隆了ー种大竹蛏Kunitz型蛋白酶抑制剂基因的cDNA全长，该基因具有SEQ ID No. I中的碱基序列，体外重组了该基因的编码蛋白，其具有SEQ ID No. 2中的氨基酸序列，该重组蛋白能抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性。该基因及其重组蛋白活性的研究，对于进一歩了解Kunitz型蛋白酶抑制剂基因在大竹蛏先天性免疫中发挥的作用，研制新的人类疾病防治药物和动物饲料添加剂具有重要的意义。本专利技术的实施例结合实验及其附图进一步说明如下SEQ ID No. I为大竹蛏丝氨酸蛋白酶抑制剂SgKunitz基因的核苷酸序列。SEQ ID No. 2为大竹蛏丝氨酸蛋白酶抑制剂SgKunitz基因编码蛋白的氨基酸序列。附图说明图I为重组大竹蛏丝氨酸蛋白酶抑制剂基因编码蛋白rSgkunitz对胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的抑制作用图。 图中▽表示胰蛋白酶在梯度浓度rSgkunitz抑制下剩余酶活性的变化曲线；〇表示糜蛋白酶在梯度浓度rSgkunitz抑制下剩余酶活性的变化曲线。具体实施例方式本专利技术的大竹蛏丝氨酸蛋白酶抑制剂SgKunitz基因具有SEQ ID No. I的碱基序列，其编码蛋白具有SEQ ID No. 2的氨基酸序列，该重组蛋白可以抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶的蛋白活性。本专利技术的大竹蛏Kunitz型蛋白酶抑制剂基因克隆及其蛋白重组的方法如下实施例I :所述的大竹蛏Kunitz型蛋白酶抑制剂基因的克隆，其具体方法如下(I)大竹経cDNA文库的构建利用Invitrogen公司的Trizol试剂从大竹経混合组织中提取总 RNA,根据ZAP-cDNA Synthesis kit 及ZAP-cDNA Gigapack III GoldCloning Kit (Stratagene)试剂盒使用说明书纯化RNA,合成第一链、第二链,加接头，XhoI限制酶消化，获得两端具有不同粘性末端的完全单向cDNA。将该片段插入Uni-ZAP XRVectordambda phage)。经包装，滴度测定和扩增，利用Exassist Helper Phage 和 SOLR 菌株从Uni-ZAP XR Vector上体外切割pBhiescript 噬菌粒，大规模提取质粒DNA进行测序。(2)序列分析与目的基因片段的获得利用Phrap软件(phragment assemblyprogram or Phil Green’s Phrap assembly, http://www. phrap. org)将获得的 EST数据进行聚类拼接，生成拼接而成的Contigs和未參与拼接的Singletons。分别将所获的Contigs与Singletons数据库中进行BLASTn和BLASTx分析。对由BLASTn和BLASTx得到的結果，根据相似性序列的功能分别将Contigs和Singletons做功能分类。通过序列比对查找所需目的基因的EST序列。(3)根据⑵步获得的EST序列，将⑴步对应的质粒转化到感受态细胞 DH5a (Transgen),选择阳性克隆，利用 M13-F (GTAAAACGACGGCCAG)和M13-R(CAGGAAACAGCTATGACC)对其进行序列測定，得到目的基因的cDNA全长。SEQ ID No. I为目的基因大竹蛏丝氨酸蛋白酶抑制剂SgKunitz基因的核苷酸序列。SEQ ID No. 2为目的基因大竹蛏丝氨酸蛋白酶抑制剂SgKunitz基因编码蛋白的氨基酸序列。实施例2:大竹蛏Kunitz型蛋白酶抑制剂基因的体外重组表达(I)利用 PCR 技术，以重组引物 GATGCTTTT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大竹蛏丝氨酸蛋白酶抑制剂SgKunitZ基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所/Jn ο2.权利要求I所述大竹蛏丝氨酸蛋白酶抑制剂SgKunitz基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。3.权利要求I所述的大竹蛏丝氨酸蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦秀梅，刘相全，杨建敏，王忠全，
申请(专利权)人：山东省海洋水产研究所，
类型：发明
国别省市：