一种将多个基因同时导入微生物基因组的方法技术

本发明专利技术公开了一种将多个基因同时导入微生物基因组的方法。本发明专利技术提供了制备表达多个外源基因的重组微生物的方法，包括如下步骤：将各个基因的表达盒一起导入宿主微生物，得到将多个外源基因整合入基因组并表达所述多个外源基因的重组微生物；第一个基因的表达盒的5’端具有同源臂甲，最后一个基因的表达盒的3’端具有同源臂乙，每个基因的表达盒的3’末端和下一个基因的表达盒的5’末端具有相同的同源臂；所述同源臂甲和所述同源臂乙可与所述宿主微生物的基因组发生同源重组。通过该方法，可以将目标代谢途径所含多个基因一步导入宿主菌株中，并按所设定的顺序排列，直接获得所需要的工程菌株，避免多次转化及载体构建所带来的麻烦。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
能源、人口及环境问题是当前的主要问题，如果将丰富的可再生资源转化成生物能源，不仅解决了能源与环境的问题，同时还节约了粮食、解决了由人口众多带来的粮食问题。 目前基因工程改造已经成为提高工业微生物菌种水平，推动生物技术产业化发展的核心技术。基因工程改造的一个重要方向是在宿主菌中导入新的基因或提高原有基因的表达量，可以通过将含有目的基因片段的表达载体转化宿主菌实现，也可以通过将目的基因片段插入到重组载体上转化宿主菌从而重组到基因组上实现，其中后者由于在菌种传代过程中更加稳定而在工业生产中得到更优先的应用。以酿酒酵母为例，其具有较强的抗逆性，是生产酒精较为理想的生产菌株，在食品、发酵等工业领域已有大量应用。随着近年来对酿酒酵母生理生化性能和发酵水平等要求的不断提高，越来越需要进行多基因操作。酿酒酵母同源重组发生的概率非常高，线性DNA片段导入酿酒酵母细胞中可以很容易在同源序列处发生同源重组，这使得在酿酒酵母中很容易实现基因的表达、基因中断、基因置换等等。但是，当所需要的表达基因过多时，具有如下局限性一方面载体构建比较困难，同时需要多次连接转化；另一方面如果载体过大，转化比较困难，不容易得到重组菌株；如果借助整合载体，基因的拷贝数往往也较低，不易实现外源基因的闻效表达。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术提供了一种制备表达多个外源基因的重组微生物的的方法，包括如下步骤将各个基因的表达盒一起导入宿主微生物，得到将所述多个外源基因整合入基因组并表达所述多个外源基因的重组微生物；当所述多个外源基因为两个外源基因时，第一个基因的表达盒的5’末端具有同源臂甲，第二个基因的表达盒的3’末端具有同源臂乙，第一个基因的表达盒的3’末端与第二个基因的表达盒的5’末端具有相同的同源臂；当所述多个外源基因为三个外源基因时，第一个基因的表达盒的5’末端具有所述同源臂甲，第三个基因的表达盒的3’末端具有所述同源臂乙，第二个基因的表达盒的5’末端与第一个基因的表达盒的3’末端具有相同的同源臂，第二个基因的表达盒的3’末端与第三个基因的表达盒的5’末端具有相同的同源臂；当所述多个外源基因为四个以上外源基因时，第一个基因的表达盒的5’末端具有所述同源臂甲，最后一个基因的表达盒的3’末端具有所述同源臂乙，每个基因的表达盒的3’末端和下一个基因的表达盒的5’末端具有相同的同源臂；所述同源臂甲和所述同源臂乙可以与所述宿主微生物的基因组发生同源重组。每个基因的表达盒均包括启动子、所述基因和终止子。所述宿主微生物可为具有高效率的基因重组能力的原核微生物或真核微生物，具体可为酵母，优选为酿酒酵母。所述同源重组的位点可为所述宿主微生物染色体DNA的任意位点，优选为所述宿主微生物的18srDNA或26srDNA。每个所述同源臂的长度均为50bp以上。所述同源臂甲具体可如序列表的序列I自5’末端第I至766位核苷酸所示。 所述同源臂乙具体可如序列表的序列2自5’末端第2425至3148位核苷酸所示。所述同源臂甲具体可如序列表的序列7自5’末端第I至1180位核苷酸所示。所述同源臂乙具体可如序列表的序列8自5’末端第1165至2281位核苷酸所示。当所述多个外源基因为两个外源基因时第一个基因的表达盒自5’末端至3’末端依次为如下元件序列表的序列7自5’末端第I至1180位核苷酸所示的同源臂甲、序列表的序列7自5’末端第1181至1778位核苷酸所示的PGK启动子、第一个基因、序列表的序列7自5’末端第3120至3460位核苷酸所示的AOX终止子；第二个基因的表达盒自5’末端至3’末端依次为如下元件序列表的序列8自5’末端第I至341位核苷酸所示的AOX终止子、序列表的序列8自5’末端第342至443位核苷酸所示的色氨酸启动子、第二个基因、序列表的序列8自5’末端第1119至1164位核苷酸所示的色氨酸终止子、序列表的序列8自5’末端第1165至2281位核苷酸所示的同源臂乙。当所述多个外源基因为三个外源基因时第一个基因的表达盒自5’末端至3’末端依次为如下元件序列表的序列I自5’末端第I至766位核苷酸所示的同源臂甲、序列表的序列I自5’末端第767至1444所示的GPD启动子、第一个基因、序列表的序列I自5’末端第2759至3047位核苷酸所示的CYC终止子；第二个基因的表达盒自5’末端至3’末端依次为如下元件序列表的序列2自5’末端第I至289位核苷酸所示的CYC终止子、序列表的序列2自5’末端第290至887位核苷酸为PGK启动子、第二个基因、序列表的序列2自5’末端第2691至3236位核苷酸所示的ADHl终止子、序列表的序列2自5’末端第3237至4643位核苷酸所示的ADHl启动子；第三个基因的表达盒自5’末端至3’末端依次为如下元件序列表的序列3自5’末端第I至1407位核苷酸所示的ADHl启动子、第三个基因、序列表的序列3自5’末端第2224至2424位核苷酸所示的组氨酸终止子、序列表的序列3自5’末端第2425至3148位核苷酸所示的同源臂乙。所述多个外源基因可为木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和G418基因；所述木糖异构酶如序列表的序列4所示；所述木酮糖激酶如序列表的序列5所示；所述G418如序列表的序列6所不。所述木糖异构酶基因具体可如序列表的序列I自5’末端第1445至2758位核苷酸所示。所述木酮糖激酶基因具体可如序列表的序列2自5’末端第888至2690位核苷酸所示。所述G418基因具体可如序列表的序列3自5’末端第1408至2223位核苷酸所示。所述木糖异构酶基因的表达盒优选如序列表的序列I所示；所述木酮糖激酶基因的表达盒优选如序列表的序列2所不；所述G418基因的表达盒优选如序列表的序列3所不。所述宿主微生物具体可为酿酒酵母W303-1B。采用本段方案得到的微生物命名为重组微生物甲。所述多个外源基因可为NADH氧化酶基因和色氨酸基因；所述NADH氧化酶基因如序列表的序列9所不；所述色氣酸基因编码序列表的序列10所不的蛋白质。所述NADH氧化酶基因具体可如序列表的序列7自5’末端第1779至3119位核苷酸所示。所述色氨酸基因具体可如序列表的序列8自5’末端第443至1118位核苷酸所示。所述NADH氧化酶基因的表达盒优选如序列表的序列7所不；所述色氣酸基因的表达盒优选如序列表的序列8所示。所述宿主微生物具体可为重组微生物甲。任一所述方法得到的重组微生物均属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供了在微生物体内将多个基因一步整合到基因组上的方法，该方法利用同源重组的原理，将所需要的多个基因表达盒同时导入宿主细胞中，通过体内自身同源重组的发生，实现将多个基因按照一定顺序一步定点整合。通过该方法，可以将目标代谢途径所含多个基因一步导入宿主菌株中，并按所设定的顺序排列，直接获得所需要的工程菌株， 避免多次转化及载体构建所带来的麻烦。附图说明图I为表达木糖代谢途径重组菌株功能性鉴定的结果.图2为表达NADH氧化酶重组菌株功能鉴定的结果。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备表达多个外源基因的重组微生物的方法，包括如下步骤将各个基因的表达盒一起导入宿主微生物，得到将所述多个外源基因整合入基因组并表达所述多个外源基因的重组微生物； 当所述多个外源基因为两个外源基因时，第一个基因的表达盒的5’末端具有同源臂甲，第二个基因的表达盒的3’末端具有同源臂乙，第一个基因的表达盒的3’末端与第二个基因的表达盒的5’末端具有相同的同源臂； 当所述多个外源基因为三个外源基因时，第一个基因的表达盒的5’末端具有所述同源臂甲，第三个基因的表达盒的3’末端具有所述同源臂乙，第二个基因的表达盒的5’末端与第一个基因的表达盒的3’末端具有相同的同源臂，第二个基因的表达盒的3’末端与第三个基因的表达盒的5’末端具有相同的同源臂； 当所述多个外源基因为四个以上外源基因时，第一个基因的表达盒的5’末端具有所述 同源臂甲，最后一个基因的表达盒的3’末端具有所述同源臂乙，每个基因的表达盒的3’末端和下一个基因的表达盒的5’末端具有相同的同源臂； 所述同源臂甲和所述同源臂乙可以与所述宿主微生物的基因组发生同源重组。2.如权利要求I所述的方法，其特征在于每个基因的表达盒均包括启动子、所述基因和终止子。3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述宿主微生物为酵母，优选为酿酒酵母。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述同源重组的位点为所述宿主微生物的18srDNA 或 26srDNA。5.如权利要求I至4中任一所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张延平，张博，孙红兵，朱泰承，李寅，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：