产色氨酸基因工程菌株的构建方法，涉及一种产色氨酸基因工程菌株的构建方法。是要解决目前色氨酸生产方法存在色氨酸产率低、成本高的问题。方法：以大肠杆菌JMl09基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得目的基因aroG和trpBA；构建pMD18-T-aroG；和pET-32a载体酶切后连接，获得连接产物X；构建pMD18-T-trpBA；和pET-30a载体酶切后连接，获得连接产物Y；将连接产物X转化感受态细胞，再将连接产物Y转入，阳性重组菌即为产色氨酸基因工程菌株。本发明专利技术构建的工程菌株可过量表达DAHP合成酶和色氨酸合成酶，减少由反应产物对色氨酸合成酶的反馈抑制，增加色氨酸产量。用于生产色氨酸。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种。
技术介绍
色氨酸化学名称为a-氨基-P-吲哚丙酸，有L型和D型同分异构体，此外还有消旋体DL-色氨酸。L-色氨酸是人和动物的必需氨基酸，參与机体蛋白质合成和代谢网络调节，广泛存在于自然界。由于L-色氨酸及其代谢产物对机体的广泛作用，其在医学、食品エ业、饲料エ业等多个领域都有一定的应用。传统色氨酸生产方法主要有蛋白水解提取法、化学合成法和酶促转化法。这3种方法分别存在着材料来源有限、需多步合成エ艺及光学拆分难、周期长、底物价格昂贵等缺 点，在エ业生产中受到极大限制，远远满足不了市场的实际需求。随着对微生物法生产色氨酸研究的不断深入，微生物发酵法已经走向生产应用并且处于主导地位，但是从葡萄糖到色氨酸的生物合成途径比较漫长，其代谢流也比较弱，而且色氨酸的合成需要多种前体物，致使色氨酸的发酵水平较低，生产成本一直较高，极大的影响了色氨酸的应用。若想进ー步提高色氨酸的积累量就必须设法增强合成这些前体物的代谢流，解除色氨酸生物合成途径中的细调系统——弱化子系统。L-色氨酸是继蛋氨酸、赖氨酸之后的第三代饲料添加剂,其使用效果是赖氨酸的3 4倍，具有十分广泛的应用前景，近年来在医药、化妆、食品、保健品等行业也得到广泛的应用。在日本、美国L-色氨酸主要应用于医药和饲料领域。饲料级L-色氨酸售价30万元/t，医药级产品进ロ价格高达80 90万元/t。目前国内使用的L-色氨酸主要依赖进ロ，而过高的价格严重影响了其在饲料添加剂行业的应用。目前在エ业上，也有用微生物发酵法生产L-色氨酸的，然而在微生物发酵生产色氨酸过程中需加入L-丝氨酸与吲哚，前者价格昂贵，后者对色氨酸合成酶抑制強烈，使得色氨酸在エ业生产中成本依然偏高，至今未取得令人满意的結果。如何提高色氨酸产率、降低生产成本是目前ー个重要课题。
技术实现思路
本专利技术是要解决目前色氨酸生产方法存在色氨酸产率低、成本高的问题，提供。本专利技术，按以下步骤进行一、用细菌基因组提取试剂盒提取大肠杆菌JM109的基因组DNA ;ニ、以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，以PI、P2为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物A用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因aroG ;三、将目的基因aroG与pMD18-T载体进行连接，构建重组载体pMD18-T-aroG ;四、以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，以P3、P4为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物B用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因trpBA ;五、将目的基因trpBA与pMD18_T载体进行连接，构建重组载体pMD18-T-trpBA ;六、将重组载体pMD18-T_aroG和pET_32a载体分别经EcoR I和BamH I进行双酶切，将酶切后的重组载体pMD18-T_aroG经I %琼脂糖凝胶电泳，胶回收aroG片段，将aroG片段和酶切后的pET_32a连接，获得连接产物X ;七、将重组载体pMD18-T-trpBA和pET_30a载体分别经EcoR I和BamH I进行双酶切，将酶切后的重组载体pMD18-T-trpBA经I %琼脂糖凝胶电泳,胶回收trpBA片段,将trpBA片段和酶切后的pET-30a连接，获得连接产物Y ;八、将连接产物X转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，涂布于含O. lmg/mL Amp的LB培养基中，次日挑取单菌落接种到含O. lmg/mL Amp的LB培养基中，于37°C振动培养12 16h，然后提取质粒进行鉴定，鉴定正确的菌落即为含有连接产物X的大肠杆菌BL21感受态细胞；九、将连接产物Y转化至含有连接产物X的大肠杆菌BL21感受态细胞中，涂布于含有O. lmg/mL Amp和O. 05mg/mL Kana的LB培养基中，次日挑取单菌落接种到含O. lmg/mLAmp和O. 05mg/mL Kana的LB培养基中，于37°C振动培养12 16h，提取质粒进行鉴定，鉴定正确的阳性重组菌即为产色氨酸基因工程菌株。本研究根据色氨酸在大肠杆菌中的合成途径，构建工程菌株过量表达催化色氨酸合成的前体物质3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮-7-磷酸(DAHP)的酶(aroG)和色氨酸合成酶(trpBA),通过过量表达aroG和trpBA,增加色氨酸合成所需前体物质的产生,减少由反应 产物对色氨酸合成酶的反馈抑制，从而增加色氨酸的产量，使这株色氨酸生产用工程菌株既能满足生产成本低的要求，又能大幅度提高色氨酸生产能力，为色氨酸的大規模エ业化生产和进一步应用打下基础。附图说明图I为具体实施方式一中蛋白电泳结果图。具体实施例方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式，按以下步骤进行一、用细菌基因组提取试剂盒提取大肠杆菌JM109的基因组DNA ;ニ、以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，以PI、P2为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物A用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因aroG ;三、将目的基因aroG与pMD18-T载体进行连接，构建重组载体pMD18-T-aroG ;四、以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，以P3、P4为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物B用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因trpBA ;五、将目的基因trpBA与pMD18_T载体进行连接，构建重组载体pMD18-T-trpBA ;六、将重组载体pMD18-T_aroG和pET_32a载体分别经EcoR I和BamH I进行双酶切，将酶切后的重组载体pMD18-T_aroG经I %琼脂糖凝胶电泳，胶回收aroG片段，将aroG片段和酶切后的pET_32a连接，获得连接产物X ;七、将重组载体pMD18-T-trpBA和pET_30a载体分别经EcoR I和BamH I进行双酶切，将酶切后的重组载体pMD18-T-trpBA经I %琼脂糖凝胶电泳,胶回收trpBA片段,将trpBA片段和酶切后的pET-30a连接，获得连接产物Y ;八、将连接产物X转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，涂布于含O. lmg/mL Amp的LB培养基中，次日挑取单菌落接种到含O. lmg/mL Amp的LB培养基中，于37°C振动培养12 16h，然后提取质粒进行鉴定，鉴定正确的菌落即为含有连接产物X的大肠杆菌BL21感受态细胞；九、将连接产物Y转化至含有连接产物X的大肠杆菌BL21感受态细胞中，涂布于含有O. lmg/mL Amp和O. 05mg/mL Kana的LB培养基中，次日挑取单菌落接种到含O. lmg/mLAmp和O. 05mg/mL Kana的LB培养基中，于37°C振动培养12 16h，提取质粒进行鉴定，鉴定正确的阳性重组菌即为产色氨酸基因工程菌株。本实施方式步骤一中细菌基因组提取试剂盒购买自康为世纪公司；步骤一中大肠杆菌JM109购买自大连宝生物工程有限公司；胶回收试剂盒购买自OMEGA公司；质粒提取试剂盒购买自大连宝生物工程有限公司；步骤六和步骤七中的胶回收是采用胶回收试剂盒进行。PMD18-T载体购买自大连宝生本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.产色氨酸基因工程菌株的构建方法，其特征在于产色氨酸基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行 一、用细菌 基因组提取试剂盒提取大肠杆菌JM109的基因组DNA ;ニ、以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，以PI、P2为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物A用I %琼脂糖凝胶电泳检測，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因aroG ;三、将目的基因aroG与PMD18-T载体进行连接，构建重组载体pMD18-T-aroG ;四、以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，以P3、P4为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物B用I %琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，获得目的基因trpBA ;五、将目的基因trpBA与pMD18_T载体进行连接，构建重组载体pMD18-T-trpBA ;六、将重组载体pMD18-T_aroG和pET_32a载体分别经EcoRI和BamHI进行双酶切，将酶切后的重组载体pMD18-T_aroG经I %琼脂糖凝胶电泳，胶回收aroG片段，将aroG片段和酶切后的pET_32a连接，获得连接产物X ;七、将重组载体pMD18-T-trpBA和pET_30a载体分别经EcoR I和BamH I进行双酶切，将酶切后的重组载体pMD18-T-trpBA经I %琼脂糖凝胶电泳，胶回收trpBA片段，将trpBA片段和酶切后的pET-30a连接，获得连接产物Y ;八、将连接产物X转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，涂布于含O. lmg/mL Amp的LB培养基中，次日挑取单菌落接种到含O. lmg/mL Amp的LB培养基中，于37°C振动培养12 16h，然后提取质粒进行鉴定，鉴定正确的菌落即为含有连接产物X的大肠杆菌BL21感受态细胞；九、将连接产物Y转化至含有连接产物X的大肠杆菌BL21感受态细胞中，涂布于含有O. lmg/mL Amp和O. 05mg/mL Kana的LB培养基中，次日挑...
【专利技术属性】
技术研发人员：于冲，夏海华，曲晓军，王金英，孙建华，李思明，
申请(专利权)人：黑龙江省科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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