The invention discloses a transgenic carnation Moonshade strain specific qualitative and quantitative PCR detection method, which comprises the following steps: 1) extracting transgenic carnation genome of Moonshade DNA; 2) transgenic carnation Moonshade gene insertion site flanking the left border of separation and identification of column order; 3) transgenic carnation Moonshade qualitative PCR detection; 4) transgenic carnation Moonshade quantitative detection of PCR. The invention is applicable to the establishment of transgenic carnation Moonshade strains specific qualitative and quantitative PCR detection method, and validate the detection specificity and sensitivity, provide an important basis for the transgenic carnation import inspection and supervision and environmental safety evaluation.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于转基因植物检测
，具体涉及。
技术介绍
随着转基因植物产业化水平不断提高，其安全问题已经引起国际社会和各国政府的广泛关注，并成为国家之间环境保护、国际贸易等合作的敏感议题，致使转基因产品的安全性问题由学术观点分歧，发展到环境问题、经济问题甚至政治问题。为了加强对转基因植 物的管理，世界各国纷纷制定了相应的法律法规。其中，转基因产品标识制度已成为国际公约。澳大利亚和新西兰从2001年7月开始对所有转基因食物实施标识制度，阈值为每种成分的1%，即当某一种成分内的转基因成分超过1%，则必须标识为转基因食物。巴西、以色列等国也把转基因成分阈值定为1%。韩国和日本分别为3%和5%。建立健全转基因产品标识制度，转基因产品的检测技术是关键。目前世界上常用的转基因检测方法主要有两种一种是基于核酸的检测方法，一种是基于蛋白质的免疫学检测方法。在转基因植物及其加工产品的检测过程中，以DNA检测为基础的核酸检测方法已经成为最主要、最适用的转基因植物及其加工产品的检测方法。基于DNA分子为基础的转基因产品检测方法经历了四个发展阶段，即(I)针对启动子、终止子、标记基因的筛选检测；(2)目的基因特异性检测；(3)基因构建特异性检测；(4)品系特异性(转化事件)检测。由于品系特异性检测方法具有高度特异性，目前国际上对于转基因产品检测方法已逐步过渡到品系特异性基因片段的检测方法。品系特异性检测是通过分析外源插入载体与植物基因组的连接区序列实现的。由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝的，所以品系特异性检测...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法，包括以下步骤 1)转基因香石竹Moonshade基因组DNA的提取； 2)转基因香石竹Moonshade外源基因插入位点的左边界旁邻序列的分离和确认利用LM-PCR方法分离得到包括如SEQ ID Nol所示的194bp未知序列和130bp的外源插入载体序列；根据该未知序列设计引物GenomeClF/GenomeClR进行PCR扩增,PCR扩增结果证明如SEQ ID Nol所示的序列为香石竹基因组序列，即转基因香石竹Moonshade外源基因插入位点的左边界旁邻序列如SEQ ID Nol所示； 3)转基因香石竹Moonshade的定性PCR检测采用Moonshade品系特异性定性引物对shadeClF/shadeClR 进行定性 PCR 扩增； 4)转基因香石竹Moonshade的定量PCR检测由转基因香石竹Moonshade基因组DNA作为标准品，采用Moonshade品系特异性定量引物对shadeRlF/shadeRIR和探针shade-Probe进行定量PCR扩增，同时，采用内标准基因ans特异性定量引物对ANS-F2/ANS-R2序列和探针ANS-Probe进行内标准基因定量PCR，并建立品系特异性定量标准曲线和内标准基因ans的定量标准曲线；再利用相对定量法对样品进行定量检测； 其中，引物GenomeClF/GenomeClR，其序列分别如SEQ ID No2和SEQ ID No3所示；引物对 shadeClF/shadeClR序列分别如 SEQ ID No4 和 SEQ ID No5 所示；定量引物对 shadeRlF/shadeRIR 和探针 shade-Probe 序列分别如 SEQ ID No6、SEQ ID No7 和 SEQ ID No8 所示；内标准基因ans特异性定量引物对ANS-F2/ANS-R2序列和探针ANS-Probe序列如SEQ IDNo9、SEQ ID NolO 和 SEQ ID Noll 所示。2.根据权利要求I所述的品系特异性定性、定量PCR检测方法，其特征在于，所述LM-PCR方法的扩增反应体系为第I轮扩增反应总体积30iiL，3iiLlXPCR缓冲液，3u L2mM dNTPs，I y LlO y M引物Cl，I y LlO y M引物MP1，0. 3 y L5U LA-Taq DNA聚合酶，2 y LMoonshade DNA, 19. 7 u L 双蒸水；第2 轮反应:总体积 30 u L,3u L I XPCR 缓冲...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐雪明，李鹏，潘爱虎，贾军伟，白蓝，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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