布氏杆菌检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术提供一种布氏杆菌检测试剂盒，所述的布氏杆菌检测试剂盒包括以布氏杆菌的OMP25基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本发明专利技术的布氏杆菌检测试剂盒检测效果更全面、漏检率低。

Brucella detection kit and method of use

The invention provides a kit for detecting brucellosis Brucella detection reagent box, which comprises the OMP25 gene of Brucella for target gene based on loop mediated isothermal amplification of two pairs of primers design: primers FIP/BIP and outer primers F3/B3. The brucellosis detection kit of the invention has more comprehensive detection effect and low rate of missed detection.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测试剂，具体涉及一种。
技术介绍
·布氏杆菌是一种革兰氏阴性的不运动细菌，它作为细胞内寄生菌可以在很多种家畜体内存活.对人造成感染的主要是马耳他布氏杆菌(马尔他热)，流产布氏杆菌，牛、羊布氏杆菌、猪布氏杆菌和狗布氏杆菌。人患后，首先出现的症状是发烧，体温可达38-40度，持续时间长，处于长期低热状态；有的人体温呈波浪状，即高热几天，体温降下来几天，又开始高，反复多次，所以布病又称浪状热。因此准确、快速地检测布氏杆菌具有十分重要的意义。传统布氏杆菌检测方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中恒温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步,现已建立起来的环介导恒温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性。因此，需要一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的以解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的布氏杆菌检测试剂盒。本专利技术的目的可以通过以下技术措施实现一种布氏杆菌检测试剂盒，所述的布氏杆菌检测试剂盒包括以布氏杆菌的0MP25基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本专利技术检测的是0MP25基因。该0MP25基因是布氏杆菌外膜蛋白基因。与NCBI网站nt数据库的BLAST比对结果显示，除布氏杆菌外，无其它菌带有该基因。作为本专利技术布氏杆菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的两对引物为外引物F3 (I) (SEQ ID NO I)CCTTTGCTGGCTGGAACT外引物B3 (I) (SEQ ID NO 2)GCAATACCAGCCGTGAGG内引物FIP (I) (SEQ ID NO 3)GTCCTTGGACTTCTTGGCCCAGttttTCCAGCAGGACCAGATCG内引物BIP (I) (SEQ ID NO 4)GGCCTGGAAGTCAAGCAGGGttttACGGCATAACCGGGTTCA或外引物F3 (2): (SEQ ID NO 5)CAAGACCAGCACCGTTGG外引物B3 (2) (SEQ ID NO 6)GGTTCAGGTCGTAGCCGA内引物FIP (2) (SEQ ID NO 7)GGTCCTGCTGGAAGTTCCAGCttttAGCATCAAGCCTGACGATTG内引物BIP (2) (SEQ ID NO 8)CGGTGTTGAAGGTGATGCAGGTttttTTCAA AGCCCTGCTTGACTT或外引物F3 (3) (SEQ ID NO 9)CGTCGGCTACGACCTGAA外引物B3 (3): (SEQ ID NO 10)ACCGGCCAGATCATAGTTCT内引物FIP (3) (SEQ ID NO 11)TCGTCCAAGCCGTTGTTAAGCTttttCCCGGTTATGCCGTACCT内引物BIP (3) (SEQ ID NO 12) GTGCCGGTCTCGAAGCCAAGttttTGTTGCCGTACTGGGTGTA或外引物F3 (4): (SEQ ID NO 13)ATTGCCGGTTCGCAGATC外引物B3 (4): (SEQ ID NO 14)GCGGATATCCTGCGTGTC内引物FIP (4) (SEQ ID NO 15)TCAGCTTGGCTTCGAGACCGttttCTTAACAACGGCTTGGACGA内引物BIP (4) (SEQ ID NO 16)GGCCGCGTTGAGTACCGTTAttttAGCTTGTTGCGAACAGTCG。作为本专利技术布氏杆菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的布氏杆菌检测试剂盒还包括BstDNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液。作为本专利技术布氏杆菌检测试剂盒的更优选实施方式，所述的BstDNA聚合酶酶浓度4-10U/ U L ；所述的反应液含1.6 2mmol/L dNTP、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/L KCl、10 12. 5mmol/L(NH4)2S04、8 10mmol/L MgS04、0. I 0. 125 体积％ TritonX-100、0.8 lmol/L甜菜碱；所述的样品预处理液含10 20mmol/L pH8. 0 的 Tris-HCl、I 2mmol/L EDTA和I I. 2 体积 %Triton X-100 ;所述的显色液为SYBR Green I 或 Eva Green ；所述稳定液为石蜡油；所述的阳性对照为布氏杆菌基因组DNA ；所述的内引物FIP/BIP各为I. 2 2. 0 ii mol/L，外引物F3/B3的浓度各为0. 2 0.25umol/L。作为本专利技术布氏杆菌检测试剂盒的最优选实施方式，所述的BstDNA聚合酶酶浓度8U/ ii L ;所述的反应液含2mmol/LdNTP、25mmol/L Tris-HCl>12. 5mmol/LKCl> 12. 5mmol/L (NH4) 2S04、10mmol/L MgS04、0. 125 体积 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜碱；所述的样品预处理液含20mmol/LpH8. 0 的 Tris_HCl、2mmol/LEDTA 和 I. 2 体积 %Triton X-I00 ;所述的显色液为SYBR Green I ；所述的内引物FIP/BIP的浓度为0. 2 ii mol/L ；所述的外引物F3/B3的浓度为I. 6 ii mol/L。作为本专利技术布氏杆菌检测试剂盒的优选实施方式，所述的布氏杆菌检测试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。作为本专利技术布氏杆菌检测试剂盒的更优选实施方式，所述的A、B两个空腔中分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为反应液和BstDNA聚合酶混合而成。本专利技术还提供一种布氏杆菌检测试剂盒的使用方法，该方法包括如下步骤(I)将待测样品离心，去上清，得到沉淀；( 2)将步骤(I)的沉淀加入样品预处理液，混合均匀，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心，上清即为样品模板DNA;(3)在反应容器中加入BstDNA聚合酶0. 9 I. 8体积份数、反应液38 40体积本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种布氏杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述的布氏杆菌检测试剂盒包括以布氏杆菌的0MP25基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对弓丨物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。2.根据权利要求I所述的布氏杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述的两对引物为 外引物F3 CGTCGGCTACGACCTGAA外引物B3 ACCGGCCAGATCATAGTTCT内引物FIP TCGTCCAAGCCGTTGTTAAGCTttttCCCGGTTATGCCGTACCT内引物BIP GTGCCGGTCTCGAAGCCAAGttttTGTTGCCGTACTGGGTGTA 或 外引物F3 ATTGCCGGTTCGCAGATC外引物B3 GCGGATATCCTGCGTGTC内引物FIP TCAGCTTGGCTTCGAGACCGttttCTTAACAACGGCTTGGACGA内引物BIP GGCCGCGTTGAGTACCGTTAttttAGCTTGTTGCGAACAGTCG。3.根据权利要求I所述的布氏杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述的布氏杆菌检测试剂盒还包括BstDNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液。4.根据权利要求3所述的布氏杆菌检测试剂盒，其特征在于， 所述的BstDNA聚合酶酶浓度4-10U/ μ L ； 所述的反应液含1. 6 2mmol/L dNTP、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/LKCl、10 12. 5mmol/L (NH4)2SO4,8 10mmol/L MgS04、0. I 0· 125 体积％ TritonX-100、0.8 lmol/L甜菜碱； 所述的样品预处理液含10 20mmol/L pH8. O的Tris_HCl、l 2mmol/LEDTA和I 1.2 体积 %Triton X-100 ; 所述的显色液为SYBR Green I或Eva Green ； 所述稳定液为石蜡油； 所述的阳性对照液为布氏杆菌基因组DNA ； 所述的内引物FIP/BIP各为1.2 2. Oymol/L，外引物F3/B3的浓度各为O. 2 O.25 μmol/L05.根据权利要求4所述的布氏杆菌检测试剂盒，其特征在于， 所述的BstDNA聚合酶酶浓度8U/ μ L ; 所述的反应液含2mmol/L dNTP、25mmol/L Tris-HCl、12. 5mmol/L KC1、12. 5mmol/L(NH4) 2S04、10mmol/L MgS04、0. 125 体积 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜碱；所述的样品预...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹以诚，陈守义，杜正平，宋榴艳，冯雪梅，邓志爱，陈洵，杨智聪，
申请(专利权)人：广州华峰生物科技有限公司，广州市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：