β-1,4-内切木聚糖酶(Aor Xyn11A)基因耐热性改造的理性设计及杂合酶的制备制造技术

本发明专利技术提出了一种新型地利用计算机技术与生物信息学方法对常温的木聚糖酶进行理性设计，运用基因工程的方法构建杂合木聚糖酶工程菌以及重组杂合木聚糖酶的高效表达的方法。将来源于米曲霉(Aspergillus?oryzae)CICC?40186菌株的常温木聚糖酶基因进行热稳定性定向改造，获得了两种杂合木聚糖酶，其热稳定性有了很大的提高，作为一种耐热型的酶制剂，该木聚糖酶具有较大的工业化生产潜力和经济价值。

Beta -1,4- endo xylanase (Aor Xyn11A) gene transformation of the rational design of heat resistance and hybrid enzyme preparation

The invention provides a new method to use the computer information technology and biology of normal xylanase rational design method for the construction of efficient expression of hybrid xylanase engineering bacteria and the recombinant hybrid xylanase using genetic engineering methods. Derived from Aspergillus oryzae (Aspergillus? Oryzae) CICC? 40186 strains at room temperature for the thermal stability of xylanase gene orientation transformation, obtained two kinds of hybrid xylanase and its thermal stability has been greatly improved, as a kind of heat resistant enzymes, the xylanase has a large industrial production potential and economic value.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的常温木聚糖酶(Aor XynllA)基因进行热稳定性的定向改造，杂合木聚糖酶工程菌的构建及重组杂合木聚糖酶的高效表达的方法，属于生物工程

技术介绍
木聚糖酶(EC 3. 2. I. 8)是一类重要的工业用酶。它主要是作用于木聚糖主链，随机地切开木聚糖内部的木糖苷键，水解产物主要为不同聚合度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶中最关键的酶。近几年，由于木聚糖酶在饲料工业、食品加工及酿造等行业具有潜在的工业应用和经济价值，尤其是在工业造纸上的应用，减少因漂白产生的环境污染，受到了越来越多的关注。然而在许多工业中，木聚糖酶都需要在高温条件下进行操作，因此 对木聚糖酶耐热性的研究也引起了国内外研究的高度重视。开发耐热型木聚糖酶的研究主要包括筛选超耐热的木聚糖酶生产菌和利用基因工程对酶分子进行定向改造，相对于筛菌技术的盲目性，后者具有更强的针对性，受到国内外学者的亲睐。根据木聚糖酶催化区域的结构和性质分析，可将其分为不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。由于G/11家族的木聚糖酶分子量较小，且结构比较简单，更适合作为理论研究的分子模型，可以用于极端条件下木聚糖酶催化模式系统及蛋白质分子折叠机理等的研究。基因工程技术、生物信息学以及计算机科学的快速发展，为分子生物学的研究开辟了新的前景。我们可以运用大规模高性能的计算机及其相关软件，结合基因工程手段，利用模拟试验对酶分子进行定向改造以提高热稳定性，加速木聚糖酶在各种领域中的应用过程。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型地利用计算机技术与生物信息学方法对常温的木聚糖酶进行理性设计，运用基因工程的方法构建杂合木聚糖酶工程菌以及重组杂合木聚糖酶的高效表达的方法。将源自A. oryzae CICC 40186的第11家族的木聚糖酶命名为AorXynllA，其相应的基因命名为Aor xynllA ;采用的模板为同家族的超耐热木聚糖酶，将其命名为EvXynATS，基因序列为EvXynATS ;由定向改造得到的两种杂合木聚糖酶分别命名为a -Aor xynl IAts β -Aor xynllATS,其相应的基因为 a -Aor xynl IAts β -Aor xynl I Ats ,其热稳定性有了很大的提高，有较大的工业化生产和应用潜力以及经济价值。本专利技术的技术方案一种来源于A. oryzae CICC 40186的木聚糖酶基因(AorxynllA)在计算机辅助下进行理性设计,得到两种杂合木聚糖酶a -Aor XynlIAts,其完整的 mRNA 序列分别为 SEQ ID NO l,R β-Aor Xyn I IAts，其完整的 mRNA 序列为 SEQ ID NO:3。这两种酶统称为Aor XynllAis0A. oryzae菌株购于中国工业微生物菌种保藏中心(China Center of IndustrialCulture Collection, CICC)，编号为 40186。所述的由完整mRNA推导的α-Aorβ-Aor XynlIAts氨基酸序列分别为 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO :4。所述的重组木聚糖酶的活性测定方法 于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 4. 6、柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配制的质量浓度为O. 5%的桦木木聚糖(Sigma, USA)溶液2. 4mL, 50°C预热IOmin,在A管中加入O. ImL适当稀释的酶液，50°C准确反应15min;立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加O. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖(以木糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义在本测定条件下，以每分钟产生I μ mo I还原糖所需的酶量定义为I个木聚糖酶活性单位(IU)。所述的耐热杂合木聚糖酶基因的设计、克隆及表达(I)同源建模模拟Aor XynllA的空间结构登录蛋白质结构数据库Protein databank (http: / / rcsb. org),经BLAST比对,找到与Aor XynllA具有高度同源序列。本实验选择具有非常高的热稳定的EvXynATS (Protein Data Bank登录号为2VUL,本实验室已经合成这段基因序列)为模板，并且两者的同源性为66. 49%，运用SWISS-MODEL服务器在线全自动为Aor XynllA构建空间结构。运用软件Verify_3D对同源建模的结构模型进行评估和优化，获得准确性较高的空间结构模型。其中，由于Aor XynlIA存在一段长度为44个氨基酸的信号肽，因此在同源建模过程中去掉这一段序列，为了保证后续分子动力学研究的准确性，需要充分评估建模获得的三级结构的可靠性。(2)利用分子动力学(Molecular Dynamics, MD)模拟的方法理性设计热稳定性提高的杂合基因使用GR0MACS4. O软件对由(3)得到的Aor XynllA空间结构和耐热型EvXynAis分别进行分子动力学模拟。采用的力场是GR0M0S96力场，该力场中蛋白的立场参数数据均给予实验值拟合。模拟温度为300K，溶剂采用TIP3P水模型。对于每个模拟体系，均在溶质外围加上I. 5nm的水分子层。MD模拟之前，对体系分别进行了两次能量优化，首先约束溶质，用最陡下降法优化800步，再用共轭梯度法优化1200步。然后去约束后再进行800步最陡下降法优化，1200步共轭梯度法优化。MD模拟分为两步首先进行20ps的约束溶质分子的MD模拟，此时温度从OK逐步升高到300K ;接着进行500ps的无约束恒温MD模拟。最后分别得到常温Aor XynllA和超耐热EvXynATS总体能量和RMSD值及Aor XynllA各个氨基酸的B-factor值。(3)杂合基因α-Aor XynllATlP β-Aor XynllATS及其表达质粒的构建根据GenBank上EvXynATS基因序列(登录号为EU 591743. I)设计引物EF，与Aor xynllA公用引物的TMl, TM2 EF 5/ -GAATTCAACGCTCAAACTTGTCTTACC-3'，含 EcoR I 酶切位点TMl 5/ ~TGCCGACGTTGGACCAGTTAGAAGTGTAACGA~3/，含公共序列TM2 5/ -GAAGCTTCCGGAGTAGGTGATGTTACGACGACTTCCAG-3'以本实验保存的PUCm-T-EvXynATS为模板，以EF和TMl为引物进行第一轮PCR ;以本实验室保存的pUCm-T-Aor xynllA为模板，以第一轮PCR反应液和XynllA-R为引物进行第二轮PCR ;将引物EF在冰上直接加入到上一轮PCR管中，进行第三轮PCR。将第三轮PCR产物用I %琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T- a -Aorxynl 1ATS)，pUCm-T- β -Aor xynl本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186、归属于糖苷水解酶第11家族的常温木聚糖酶基因Aor xynllA,以另一个同家族的超耐热木聚糖酶基因EvXynATS为模板，利用计算机技术及其相关软件，结合分子动力学模拟的方法，对Aor XynllA分子进行理性设计，定向改造以提高热稳定性。2.利用分子动力学模拟的方法理性设计热稳定性提高的杂合基因 (1)同源建模模拟AorXynllA的空间结构登录蛋白质结构数据库Protein databank (http: //rcsb. org),经BLAST比对,找到与Aor XynllA具有高度同源的序列；本实验选择热稳定非常高的EvXynATS (Protein Data Bank登录号为2VUL)为模板，并且两者的同源性为66. 49%，运用SWISS-MODEL服务器在线全自动为A. oryzae常温木聚糖酶成熟肽构建空间结构；运用软件Verify_3D对同源建模的结构模型进行评估和优化，获得准确性较闻的空间结构|旲型； (2)利用分子动力学模拟的方法理性设计热稳定性提高的杂合基因使用GR0MACS4.0软件对由(I)得到的Aor XynllA空间结构和耐热型EvXynATS分别进行分子动力学模拟；采用的力场是GR0M0S96力场，该力场中蛋白的立场参数数据均给予实验值拟合；模拟温度为300K，溶剂采用TIP3P水模型；对于每个模拟体系，均在溶质外围加上I. 5nm的水分子层；MD模拟之前，对体系分别进行了两次能量优化，首先约束溶质，用最陡下降法优化800步，再用共轭梯度法优化1200步；然后去约束后再进行800步最陡下降法优化，1200步共轭梯度法优化；MD模拟分为两步首先进行20ps的约束溶质分子的MD模拟，此时温度从OK逐步升高到300K ;接着进行500ps的无约束恒温MD模拟；最后分别得到常温Aor XynllA和超耐热EvXynATS总体能量和RMSD值及Aor XynllA各个氨基酸的B_factor值； 我们分别将由MD得到的Aor XynllA和已知的EvXynATS各个氨基酸的B-factor值导入到PDB文件中，使用B-FITTER软件导出各个氨基酸的B-factor值，由作图可以看出EvXynATS序列中各氨基酸的柔性较小，波动幅度较为平均，而Aor XynllA序列尤其是N端较为不稳定，可通过N端序列替换方法进行分子改造；我们分别随机选取Aor XynllA的N端适当氨基酸数分别用EvXynATS相应的序列进行替换改造，然后我们以EvXynATS为模板，分别对杂合木聚糖酶进行同源建模，然后运用分子动力学模拟方法分别对杂合蛋白进行计算总体能量及RMSD值。由结果我们得出将Aor XynllA的N端37个氨基酸由EvXynATS的N端42个氨基酸替换，S卩a-Aor XynllAτs，及62个EvXyn...

【专利技术属性】
技术研发人员：邬敏辰，高树娟，张慧敏，李剑芳，汪俊卿，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：