本发明专利技术公开了一种优化的硫化物醌氧化还原酶基因及其表达载体，属于基因工程技术领域。该优化的硫化物醌氧化还原酶基因（sqr）核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。优化后的sqr基因片段核苷酸序列与原序列比对相似性为81%，427个氨基酸中有228个氨基酸的密码子得到优化，优化率达到54%。本发明专利技术从培育环境友好型动物新品种的角度出发，为转基因动物的制备探路，以期从转基因全新的角度降低动物养殖场中硫化氢气体的排放，从根本上解决养殖产业中的环境污染问题。
Optimized sulfide quinone oxidoreductase gene and expression vector thereof
The invention discloses an optimized sulfide quinone oxidoreductase gene and an expression vector thereof, belonging to the field of gene engineering technology. The optimized sulfur quinone oxidoreductase gene (SQR) nucleotide sequence, as shown in SEQIDNO:1. The similarity between the nucleotide sequence and the sequence alignment of the optimized SQR gene fragment was 81%. The codon of 228 amino acids in 427 amino acids was optimized, and the optimization rate was 54%. The present invention starting from the cultivation of new varieties of environmental friendly animal perspective, Pathfinder preparation for transgenic animal, in order to reduce the hydrogen sulfide gas emissions from animal farms in transgenic new perspective, to solve the problem of environmental pollution in the aquaculture industry fundamentally.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种优化的硫化物醌氧化还原酶基因及其表达载体。
技术介绍
畜牧业规模化养猪产生的废气对周围环境造成了较大的污染，而H2S是产生恶臭气味的重要因素之一，可使畜禽生产性能下降，造成幼仔中毒死亡，给农业生产和人民生活都造成较大的影响。随着转基因技术的发展，培育减排H2S的环境友好型转基因猪便成为可能，它可以从根本上缓解养殖场产生的环境问题。生活在潮湿恶臭环境中的光合细菌荚膜红细菌capsulatus)中产生一种膜结合蛋白_硫化物醌氧化还原酶(Sulfide-quinone reductase, SQR),可以利用H2S作为氢供体为光合细菌提供能量。 虽然荚膜红细菌可以产生SQR蛋白，但因该细菌生长条件较难控制，将其进行工业化生产仍然受到限制，所以如何制备适于工业化生产的重组细菌成为目前研究的课题。外源蛋白的表达水平与多种因素有关，如启动子和终止子的强弱、质粒拷贝数、蛋白稳定性、翻译效率，表达系统和宿主的兼容性等。其中，宿主密码子偏好性是影响外源蛋白表达的重要因素之一。无论在原核表达系统还是真核表达系统，稀有密码子过多会严重影响蛋白的表达，导致表达水平急剧下降；而偏离规范的密码子，即不同的生物能把同种密码子识别为不同的氨基酸，将直接导致了基因不能进行异源表达或者只表达出无活性的蛋白质。目前，克服制约瓶颈现象解决的主要策略是在不改变所编码蛋白的氨基酸序列基础上，通过序列定点突变或全基因合成手段，从基因本身更改特有的稀有密码子从而实现功能蛋白的异源表达。而对于SQR蛋白的基因优化目前还属于空白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种优化的硫化物醌氧化还原酶基因。本专利技术的另一目的是提供上述优化的硫化物醌氧化还原酶基因的表达载体。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的 一种优化的硫化物醌氧化还原酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。本研究对sqr基因进行优化的时候兼顾以下几个方面尽量使用偏好密码子，以提高mRNA的翻译效率；降低GC含量，调整基因AT含量，防止提前终止；去除sqr基因中影响mRNA有效翻译和稳定性的二级结构；除去使mRNA不稳定和降解的序列和结构。实验表明优化后的基因在CHO细胞系中转录水平和翻译水平均高于其原始基因序列。优化后的sqr基因片段核苷酸序列与原序列比对相似性为81%，427个氨基酸中有228个氨基酸的密码子得到优化，优化率达到54%。一种硫化物醌氧化还原酶的表达载体,该表达载体是由优化的硫化物醌氧化还原酶基因插入到表达载体(也称出发载体)的多克隆位点构建而成。所述出发载体优选原核表达载体为大肠杆菌表达载体pRSET A、或真核表达载体pcDNA3. I。一种转基因细胞系，是由上述硫化物醌氧化还原酶的表达载体转染到宿主细胞构建而成。本专利技术的优化的硫化物醌氧化还原酶基因在制备转基因动物中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果 本研究对光合细菌(荚膜红细菌)中的硫化物醌还原酶(sqr)基因进行了优化，使其在表达量上高出正常菌株，从培育环境友好型动物新品种的角度出发，为转基因猪的制备探路，以期从转基因全新的角度降低养殖场中硫化氢气体的排放，从根本上解决养猪产业中的环境污染问题。 附图说明图I.荚膜红细菌sqr2基因PCR扩增结果，其中1、2为sqr2基因；M :DNA分子量标准。图2 . sqr基因的信号肽预测。图3. sqr基因优化前后的CAI值及密码子频率分布。图4. sqr基因优化前后mRNA 二级结构。图5.重组质粒pRSET A-sqr的菌液PCR鉴定，I 阴性对照；2飞=PCR扩增重组质粒pRSET A-sqr ；M DNA分子量标准。图6.不同诱导时间的pRSETA-sqr融合蛋白表达。0 :IPTG诱导空载体pRSETA的表达；M :分子量标准蛋白Marker ;1 7 :IPTG分别诱导0、2、4、5、6、7、8h时pRSETA-sqr的表达。图7. SQR原核表达产物的Western-blot验证，M :分子量标准蛋白Marker ；1 pRSETA 载体；2 pRSETA-sqr2 融合蛋白。图8. 15min内不同浓度的decyl_UQ反应情况(A)和双倒数法求SQR酶的Km值(B)。图9.真核表达载体 pcDNA3. I-SQR(A)与 pcDNA3. 1-SQR2 (B)的构建。M DL5000marker ； I :重组载体；2 :重组载体的Xho I和Kpn I双酶切结果。图10. CHO细胞的总RNA抽提。图11. sqr与sqr2的mRNA相对表达。图 12. pcDNA3. 1-sqr 与 pcDNA3. I_sqr2 融合蛋白表达，SQR pcDNA3. 1-sqr 融合蛋白；SQR2: pcDNA3. I_sqr2融合蛋白；B pcDNA3. IB空载体；L :未进行转染的CHO细胞。图13. sqr2转基因小鼠总RNA抽提结果。图14. sqr2基因在转基因小鼠不同组织的表达情况，1_13分别为心、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肠道、肌肉、腮腺、颌下腺、舌下腺、水、阳性质粒。图15. Western blot验证SQR蛋白在转基因小鼠各组织的表达情况，a (_)、c(-):转基因阴性小鼠；b (+)、d(+):转基因阳性小鼠。图16. Western blot验证SQR蛋白在转基因小鼠各组织的表达情况的灰度值分析。图17.小鼠代谢收集的气体图谱代谢产生的气体(A)，粪便发酵产生的气体(B)。 图18.小鼠代谢和粪便发酵产生的气体中H2S含量分析，其中A图为小鼠代谢产生气体中H2S含量，(NaHS-(+):饲喂日常饲料的转基因阳性鼠；NaHS-(-):饲喂日常饲料的转基因阴性鼠；NaHS+(+):饲喂添加0. 56 u mol/kg NaHS饲料的转基因阳性鼠；NaHS+(-):饲喂添加0. 56 u mol/kg NaHS饲料的转基因阴性鼠。B图为粪便发酵产生的气体中H2S含量，其中，(NaHS-(+):饲喂日常饲料的转基因阳性鼠；NaHS-(-):饲喂日常饲料的转基因阴性鼠；NaHS+(+):饲喂添加0. 56 u mol/kg NaHS饲料的转基因阳性鼠；NaHS+(-):饲喂添加0. 56 u mol/kg NaHS饲料的转基因阴性鼠。具体实施例方式以下结合具体实施例进一步解释本专利技术，但实施例不对本专利技术构成任何限制，实施例中如无特殊说明，均为本领域常规实验技术。实施例中所用生物材料来源如下 荚膜红细菌{Rhodobacter capsulatus ):购于广东省微生物研究所。pMD18-T vector、pMD20_T vector、大肠杆菌表达载体pRSET A、大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3)、DH5a感受态细胞均购自Takara公司。真核表达载体pcDNA3. I购自广州英伟创津公司。实验所用的Fvb和ICR小鼠购自广州赛业公司。实施例I 一、荚膜红细菌sqr基因的克隆 购买的荚膜红细菌进行复苏扩大培养。参照GenBank 上荚膜红细菌 DSM155(Accession No. X97478. 2)的 sqr 基因序列，利用prime本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种优化的硫化物醌氧化还原酶基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。2.一种硫化物醌氧化还原酶的表达载体，其特征在于由权利要求I所述优化的硫化物醌氧化还原酶基因插入到表达载体的多克隆位点构建而成。3.根据权利要求2所述硫化物醌氧化还原酶的表达载体...
【专利技术属性】
技术研发人员：李加琪，贺艳芬，张哲，张豪，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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