本申请公开了一种人体脂肪干细胞快速提取方法及其专用人脂肪组织消化剂，该方法包括人脂肪组织处理、液状的脂肪离心、人体脂肪干细胞提取，该方法中用到的专用人脂肪组织消化剂包含胶原酶IV型、胰蛋白酶-EDTA复合体、抗胰蛋白酶和二甲基亚砜。本发明专利技术具有使脂肪间充质干细胞充分游离出来，同时保护细胞不受伤害的效果。
Human adipose stem cell rapid extraction method and its special human adipose tissue digesting agent
The invention discloses a method for rapid extraction of human adipose stem cells and special human adipose tissue digestion agent, the method includes human adipose tissue processing, liquid fat centrifugation, body fat stem cells, the method used in the special human adipose tissue contains digestive enzyme of collagen type IV, -EDTA complex, anti trypsin trypsin and two dimethyl sulfoxide. The invention has the advantages that the adipose mesenchymal stem cells are sufficiently free to protect the cells from being injured.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞工程领域，特别涉及一种人体脂肪干细胞快速提取方法及其专用人脂肪组织消化剂。
技术介绍
脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是目前广泛应用于组织工程及再生医学领域的一种成体干细胞，与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能。ADSCs呈成纤维细胞样生长，胞浆和核仁丰富，呈平行或漩涡样排列。细胞周期分析显示G0/G1期的细胞占69%，S期占24%，G2/M期占8%。在胎牛血清的存在条件下传代培养2_3天细胞增殖I倍。多次传代(10-20代)后，细胞增殖速度无明显减慢，在传代6次后细胞群体中出现衰老细胞，第15代细胞群体中衰老细胞约占15%。ADSCs具有与骨髓间充质干细胞基本 相同的细胞免疫表型，经流式细胞仪分析⑶9，⑶10，⑶13，⑶29，⑶44，⑶49d，⑶49e，⑶54，CD55, CD59, CD90, CD105, CDl 17，CD146, CD166, STRO-1 均为阳性，而 CD31, CD34, CD45 均为阴性。最大的区别是ADSCs表达⑶49d，不表达⑶106;而正好相反，BMSCs表达⑶106，不表达 CD49d。目前常用的ADSCs分离培养方法是从脂肪组织分离获取细胞，经机械和酶处理方法除去红细胞等成熟细胞后，利用饲养层细胞与含10%胎牛血清的培养基进行培养。这种培养干细胞方法的缺点是方法复杂，提取的干细胞数量少，纯度不高，继代增殖缓慢。
技术实现思路
本专利技术的一种人体脂肪干细胞快速提取方法，包括如下步骤人脂肪组织处理将人脂肪组织块加入离心管中再加入等量生理盐水而后使用组织匀浆器处理成液状加入离心管中；液状脂肪离心将盛有液状脂肪的离心管置于离心机中2400rpm/min离心5min，使液状脂肪分为上层橙黄色透明的油层、中间层黄色脂肪层、底层沉积层；脂肪层人脂肪干细胞提取移取中间层脂肪至离心管中，加入等量的人脂肪组织消化剂混勻，置于恒温振荡器中，37°C、200rpm振荡30min,而后使用离心机2400rpm/min离心lOmin，倒掉浮游脂肪，吸除液体，加入Dulbecco’ s磷酸盐缓冲液混匀，转移至另一离心管中离心后弃去上清液，加Dulbecco’s磷酸盐缓冲液混勻，2400rpm/min离心3min,洗漆2次后吸除上层液体，下层沉积细胞即为人脂肪干细胞；沉积层人脂肪干细胞提取在留有沉积层细胞的离心管中加入等量的人脂肪组织消化剂混勻，置于恒温振荡器中，37°C、200rpm振荡5min, 2400rpm/min离心IOmin,吸除上层液体，加入Dulbecco’ s磷酸盐缓冲液，混匀，转移至另一离心管中，再离心机2400rpm/min离心5min，吸除上层液体下层沉积细胞即为人脂肪干细胞。人体脂肪干细胞提取中所使用的人脂肪组织消化剂，包含胶原酶IV型0.15 2. 5mg/mL、胰蛋白酶-EDTA复合体0. 5 5mg/mL、α I抗胰蛋白酶0. Γ . 5mg/mL和二甲基亚砜5 100 μ 1/mL,胶原酶IV型的最优浓度为O. 75mg/mL,胰蛋白酶-EDTA复合体最优浓度为2. 5mg/mL, α I抗胰蛋白酶最优浓度为O. 5mg/mL, 二甲基亚砜最优浓度为30 μ Ι/mL,使用Dulbecco’ s磷酸盐缓冲液作为溶剂。上述人脂肪组织消化剂中各成分作用如下胶原酶IV型作用的是消化连接脂肪细胞间的胶原组织，加速脂肪细胞解离出来，而且不对细胞产生破坏；胰蛋白酶-EDTA复合体作用是消化脂肪细胞间基质蛋白组织，解离细胞间的连接，加速脂肪细胞从组织中游离出来，但过量胰酶复合体可以消化破坏脂肪干细胞本身需要优选；α I抗胰蛋白酶作用是终止多余的胰蛋白酶作用，保护细胞本身不受到消化的损 伤；二甲基亚砜属于非质子极性溶剂，常用于细胞冷冻培养基内，可以保护细胞免受冰晶引起的机械性损伤，高浓度DMSO的细胞毒性是诱导细胞凋亡和影响细胞生长活力。使用本专利技术提供的快速分离提取人脂肪干细胞方法及其使用的脂肪消化剂，可以使脂肪间充质干细胞充分游离出来同时保护细胞不受伤害，以获得充分游离存活率高的人脂肪干细胞。附图说明图I为本专利技术使用的三种优选浓度脂肪组织消化剂提取干细胞总量对比图。具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下面对专利技术作进一步详细的说明。实验中使用的胶原酶IV型,胰蛋白酶-EDTA复合体trypsin_EDTA, α I抗胰蛋白酶，二甲基亚砜均从Sigma公司购得。实验所用器具仪器试剂皆可通过商业途径获得。实施例I :本专利技术所述的一种用于消化人脂肪组织的人脂肪消化剂A的制备I)取 900ml 的 Dulbecco’ s 憐酸盐缓冲液(Dulbecco，s PBS, Sigma,D-8537,以下相同)，再加入青霉素和链霉素各90000U。 2 )调 pH 值用 5 % NaHCO3 溶液调节 pH 到 7. 2。3)加入高效消化剂将胶原酶IV型150mg，胰蛋白酶-EDTA复合体500mg，α I抗胰蛋白酶IOOmg和二甲基亚砜5000 μ L依次加入Dulbecco’s磷酸盐缓冲液中，使用振荡或超声助溶。4)然后补加上述Dulbecco’ s磷酸盐缓冲液至IOOOmL,即各个试剂组分取最低剂量配制而成的人脂肪消化剂A。实施例2 :本专利技术所述的一种用于消化人脂肪组织的人脂肪消化剂B的制备I)取 900ml 的 Dulbecco，s 憐酸盐缓冲液(Dulbecco，s PBS, Sigma, D-8537),再加入青霉素和链霉素各90000U。2 )调 pH 值用 5 % NaHCO3 溶液调节 pH 到 7. 2。3)加入高效消化剂将胶原酶IV型2500mg，胰蛋白酶-EDTA复合体5000mg，α I抗胰蛋白酶1500mg和二甲基亚砜100000 μ L依次加入Dulbecco’ s磷酸盐缓冲液中，使用振荡或超声助溶。4)然后补加上述Dulbecco’ s磷酸盐缓冲液至IOOOmL,即各个试剂组分取最高剂量配制而成的人脂肪消化剂B。实施例3 :本专利技术所述的一种用于消化人脂肪组织的人脂肪消化剂C的制备I)取 900ml 的 Dulbecco，s 憐酸盐缓冲液(Dulbecco，s PBS, Sigma, D-8537),再加入青霉素和链霉素各90000U。 2 )调 pH 值用 5 % NaHCO3 溶液调节 pH 到 7. 2。 3)加入高效消化剂将胶原酶IV型750mg，胰蛋白酶-EDTA复合体2500mg，α I抗胰蛋白酶500mg和二甲基亚砜30000 μ L依次加入Dulbecco’ s磷酸盐缓冲液中，使用振荡或超声助溶。4)然后补加上述Dulbecco’ s磷酸盐缓冲液至IOOOmL,即各个试剂组分取最优剂量配制而成的人脂肪消化剂C。实施例4 :人体脂肪干细胞的快速提取步骤I、取人脂肪组织块，置于500mL离心管中，加入等量生理盐水，用组织匀浆器(PR0200组织精密匀浆器，美国Pro Scientific公司)绞碎成为糜状后放入离心管中。步骤2、将盛有脂肪的离心管置于8420离心机(久保田8420，日本KUBOTA久保田公司)中2400rpm离心5min后，分本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种人体脂肪干细胞快速提取方法，包括如下步骤 人脂肪组织处理将人脂肪组织块加入离心管中，再加入等量的生理盐水而后使用组织匀浆器处理成液状的脂肪，再将已成为液状的脂肪加入离心管中； 将液状的脂肪离心使用离心机分离离心管中的液状脂肪使之分为三层，上层即油层、中间层即脂肪层、底层即沉积层； 脂肪层中人体脂肪干细胞提取移取中间层脂肪至离心管中，加入与脂肪层相等体积的人脂肪组织消化剂混匀，该消化剂包含胶原酶IV型、胰蛋白酶-EDTA复合体、α I抗胰蛋白酶、二甲基亚砜，然后置于恒温振荡器中振荡，接着离心分离后去浮游脂肪取上层液体；而后再向取出的上层液体中加入Dulbecco’ s磷酸盐缓冲液然后离心，弃去离心后的上清液取下层沉积细胞，再使用Dulbecco’ s磷酸盐缓冲液重复离心洗涤2次，下层沉积细胞即为人体脂肪干细胞； 沉积层中人脂肪干细胞提取在留有沉积层细胞的离心管中加入等体积的人脂肪组织消化剂混匀，该消化剂包含胶原酶IV型、胰蛋白酶-...
【专利技术属性】
技术研发人员：焦阳，
申请(专利权)人：江苏瑞思坦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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