一种脂肪酶高产菌的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种所产生的脂肪酶酶解乳脂肪后的产物可以用于增香的脂肪酶高产菌的筛选方法，包括如下步骤：(1)将筛选源样品添加到富集培养基中进行富集培养，得到富集培养液；(2)用无菌水稀释富集培养液，通过选择性平板培养基筛选产脂肪酶的菌，后经纯化培养获得纯化菌株；(3)将筛选出的纯化菌株在产酶培养基中培养并收获培养产物；(4)离心培养产物，收集含脂肪酶的上清液；(5)将含脂肪酶的上清液进行酶活检测，对酶活力高的菌株进行风味验证后获得目标菌株。本发明专利技术拓展了脂肪酶高产菌的筛选源，特别是将某些食品作为脂肪酶高产菌的筛选源属于首创，同时为工业化生产脂肪酶提供了新的菌种来源。

Screening method for lipase producing bacteria

The invention discloses a milk fat lipase produced by hydrolysis of the products can be used in screening methods bacteria lipase producing fragrance, which comprises the following steps: (1) will be added to the screening samples in enriched medium enriched culture, enriched culture medium; (2) using sterile water dilution enrichment culture the liquid culture medium, screening of lipase producing bacteria by selective, purified and cultured after purified strains; (3) will be screened and purified strains in fermentation medium and harvest culture products; (4) centrifugation products, supernatant was collected containing lipase; (5) the supernatant containing lipase detection of enzyme activity, enzyme activity of high strain were obtained after verification of flavor strains. The invention extends the screening source of lipase producing bacteria, in particular, uses certain foods as the screening source for lipase producing bacteria, and provides a new source of bacteria for industrialized production of lipase.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，尤其涉及一种所产脂肪酶酶解乳脂肪后的产物能够增强乳制品风味的菌的筛选方法。
技术介绍
脂肪酶即三酰甘油酰基水解酶，它催化底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶被广泛应用于食品加工及风味改革中。乳脂肪(稀奶油、奶油、黄油或无水奶油等)是乳品风味的重要来源，乳脂肪在乳制品风味形成过程中所起的作用是其他脂肪所无法替代的。乳脂肪是迄今为止已知的组成和结构最复杂的脂质，乳脂的风味很难用化学合成的物质模拟。由不同方法制得的风味物质的组分差别很大，其中由乳脂肪酶解后制备的风味物质香气自然、柔和，留香持久，对加 香产品的内在品质有明显的改善和提升，能够赋予加香产品天然的乳品香气。因而，越来越多的人们开始关注乳脂肪来源的风味添加剂。乳脂肪中的脂肪酸甘油三酯等被酶解成饱和及不饱和脂肪酸、酮酸等风味物质和风味物质前体，可作为天然来源的风味物质，应用于焙烤食品、乳制品、糖果等食品中，以达到增强产品的奶油、乳酪等香气、标准化不同生产批次广品的感官特性等效果。脂肪酶种类繁多，广泛存在于动植物和微生物体内，尤以在微生物界种类更丰富。脂肪酶的作用具有底物专一性，不同来源的脂肪酶具有不同的催化特性。因此，针对不同的应用目的需要使用不同的脂肪酶。目前国内还没有关于以食品作为脂肪酶产生菌筛选源的报道，更没有以自筛菌所产脂肪酶用于酶解乳脂肪后增强乳品香气的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种所产生的脂肪酶酶解乳脂肪后的产物可以用于增香的脂肪酶高产菌的筛选方法，特别提供了一种将食品作为脂肪酶高产菌的筛选源的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的—种脂肪酶高产菌的筛选方法，包括如下步骤(I)将筛选源样品添加到富集培养基中进行富集培养，得到富集培养液；所述的筛选源样品选自天然干酪、巴氏稀奶油和黄油中的任一种或多种；(2)用无菌水稀释富集培养液，先通过选择性平板培养基筛选产脂肪酶的菌，挑取带有荧光圈的单菌落，然后通过纯化培养获得纯化菌株；(3)将筛选出的纯化菌株在产酶培养基中培养并收获培养产物；(4)离心培养产物，收集含脂肪酶的上清液；(5)将含脂肪酶的上清液进行酶活检测，对酶活力高的菌株进行风味验证后获得目标菌株。本专利技术中，步骤(I)是将筛选源样品添加到富集培养基中进行富集培养，得到富集培养液；所述的筛选源样品选自天然干酪、巴氏稀奶油和黄油中的任一种或多种。其中，所述的筛选源样品为高脂乳品，可以选自天然干酪、巴氏稀奶油和黄油中的任一种或多种，优选天然干酪。所述的天然干酪为除霉菌干酪和酵母干酪之外的天然干酪，优选切达干酪、大孔干酪、帕莫森干酪、黄波干酪、奶油干酪和古老耶干酪中的任一种或多种。较佳地，所述天然干酪的脂肪含量为10 45%;更佳地，所述天然干酪的脂肪含量为28 45%，成熟期在I个月以上。所述筛选源样品若为固态，则在添加到富集培养基中之前还需将样品切成小丁，置于无菌水中震荡溶解。在自然界中，细菌都是混杂生长在一起的。从自然界特定的筛选源中筛选分离具有某些特性的微生物已有较常规的方法和步骤，通常都需要先进行富集培养。富集培养基的基本构成需求是，能够诱导生长某种特性的菌，同时最大限度抑制其他菌的生长。现有的中、英文文献披露了在筛选脂肪酶高产菌时，由于几乎全部是用于生物柴油方向，因此，培养基中的油脂几乎都采用橄榄油，个别采用其他植物油。而本专利技术的最终作用底物是乳脂肪，鉴于乳脂肪和植物脂肪结构的差异性、以及脂肪酶的底物专一特性，本专利技术特将培养基中的油脂改为稀奶油。至于培养基中的碳源、氮源、无机盐，则是常规使用的、能保证菌体生长的最少量物质。 本专利技术中，步骤(I)所述的富集培养基包括下列各组分①蛋白胨、酵母膏/粉、牛肉膏/粉中的任一种或多种，②无机盐和③乳化稀奶油。所述的无机盐为常规，较佳地选自氯化钠、氯化钙、硫酸镁和磷酸氢二钾中的任一种或多种。较佳地，所述的富集培养基包括下列各组分①蛋白胨0. 2 0. 8%，②酵母浸膏0 0. 8%，③氯化钠0 0. 05%，④氯化钙0 0. 01%和⑤乳化稀奶油2. 5 3. 75%，上述各组分的百分比均为质量百分比。更佳地，所述的富集培养基包括下列各组分①蛋白胨0. 5%，②酵母浸膏0. 5%，③氯化钠0.05%，④氯化钙0. 005%和⑤乳化稀奶油2.5%，上述各组分的百分比均为质量百分比。所述乳化稀奶油是用3倍体积2% (w/v)的聚乙烯醇乳化脂肪含量为35 40%的稀奶油而制得。所述富集培养的方法为常规，较佳地是在23 28°C、150 250rpm条件下，摇床培养48 72小时。本专利技术中，步骤(2)是用无菌水稀释富集培养液，先通过选择性平板培养基筛选产脂肪酶的菌，然后通过纯化培养获得纯化菌株。所述的选择性平板培养基为罗丹明选择性平板培养基，包括下列各组分①蛋白胨、酵母膏/粉、牛肉膏/粉中的任一种或多种，②乳化稀奶油，③凝固剂和④罗丹明。较佳地，所述的选择性平板培养基包括下列各组分①牛肉膏0 0. 8 %，②蛋白胨0. 2 0. 8 %，③乳化稀奶油2. 5 3. 75 %，④琼脂L 0 1.75%和⑤罗丹明0. 04 0. 06%，上述各组分的百分比均为质量百分比。更佳地，所述的选择性平板培养基包括下列各组分①牛肉膏0.5%，②蛋白胨0.5%，③乳化稀奶油2.5%，④琼脂I. 5%和⑤罗丹明0. 05%，上述各组分的百分比均为质量百分比。所述乳化稀奶油是用3倍体积2% (w/v)的聚乙烯醇乳化脂肪含量为35 40%的稀奶油而制得。所述筛选的方法为用无菌水将步骤(I)制得的富集培养液稀释成各浓度梯度，取一定量均匀涂布于选择性平板培养基上后培养48 72小时，培养温度为23 28°C ;较佳地，所述筛选的方法为用无菌水将步骤(I)制得的富集培养液富集培养液稀释105、106、107、108倍至各浓度梯度，分别取100 u I均匀涂布于选择性平板培养基，23 28°C培养48 72小时。所述纯化培养的方法为常规，只要能够培养得到纯化菌株即可，较佳地是采用PDA平板培养基、YPD平板培养基、麦芽汁培养基和察氏培养基中的任一种对产脂肪酶的菌进行纯化培养，获得纯化菌株。本专利技术中，步骤(3)是将筛选出的纯化菌株在产酶培养基中培养并收获培养产物。所述的产酶培养基包括下列各组分①蛋白胨、酵母膏/粉、牛肉膏/粉中的任一种或多种，②可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖中的任一种或多种，③无机盐和④乳化稀奶油。所述的无机盐为常规，较佳地选自氯化钠、氯化钙、硫酸镁、磷酸氢二钾中的任一种或多种。较佳地，所述的产酶培养基包括下列各组分①蛋白胨0. 2 0. 8 %，②酵母浸膏0. 2 0. 8 %，③氯化钠0. 05 0. 5 %，④可溶性淀粉0. 05 0. I %，⑤磷酸氢二钾0. 05 0. 25 %和⑥乳化稀奶油2. 5 3. 75%，上述各组分的百分比均为质量百分比。更佳地，所述的产酶培养基包括下列各组分①蛋白胨0.5%，②酵母浸膏0. 15%，③氯化钠0.5%，④可溶性淀粉0. 1%,⑤磷酸氢二钾0. 25%和⑥乳化稀奶油2. 5%，上述各组分的百分比均为质量百分比。所述乳化稀奶油是用3倍体积2% (w/v)的聚乙烯醇乳化脂肪含量为35 40%的稀奶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脂肪酶高产菌的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)将筛选源样品添加到富集培养基中进行富集培养，得到富集培养液；所述的筛选源样品选自天然干酪、巴氏稀奶油和黄油中的任一种或多种； (2)用无菌水稀释富集培养液，先通过选择性平板培养基筛选产脂肪酶的菌，挑取带有荧光圈的单菌落，然后通过纯化培养获得纯化菌株； (3)将筛选出的纯化菌株在产酶培养基中培养并收获培养产物； (4)离心培养产物，收集含脂肪酶的上清液； (5)将含脂肪酶的上清液进行酶活检测，对酶活力高的菌株进行风味验证后获得目标菌株。2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的天然干酪选自切达干酪、大孔干酪、帕莫森干酪、黄波干酪、奶油干酪和古老耶干酪中的任一种或多种。3.如权利要求I所述的方法，其特征在于， 步骤(I)所述的富集培养基包括下列各组分①蛋白胨、酵母膏/粉、牛肉膏/粉中的任一种或多种，②无机盐和③乳化稀奶油； 步骤(2)所述的选择性平板培养基包括下列各组分①蛋白胨、酵母膏/粉、牛肉膏/粉中的任一种或多种，②乳化稀奶油，③凝固剂和④罗丹明； 步骤(2)所述纯化培养为采用PDA平板培养基、YPD平板培养基和察氏培养基中的任一种对产脂肪酶的菌进行纯化培养，获得纯化菌株； 步骤(3)所述的产酶培养基包括下列各组分①蛋白胨、酵母膏/粉、牛肉膏/粉中的任一种或多种，②可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖中的任一种或多种，③无机盐和④乳化稀奶油； 所述的无机盐选自氯化钠、氯化钙、硫酸镁和磷酸氢二钾中的任一种或多种；所述乳化稀奶油是用3倍体积2% (w/v)的聚乙烯醇乳化脂肪含量为35 40%的稀奶油而制得。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于， 所述的富集培养基包括下列各组分①蛋白胨0. 2 0. 8%，②酵母浸膏0 0. 8%，③氯化钠0 0. 05%，④氯化钙0 0. 01%和⑤乳化稀奶油2. 5 3. 75% ;上述各组分的百分比均为质量百分比； 所述的选择性平板培养基包括下列各组分①牛肉膏0 0. 8 %，②蛋白胨0. 2 0. 8%，③乳化稀奶油2. 5 3. 75%，④琼脂I. 0 I. 75%和⑤罗丹明0. 04 0. 06% ;上述各组分的百分比均为质量百分比...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗君莅，张锋华，刘振民，肖杨，孟令洁，任璐，蔡涛，王辉，
申请(专利权)人：光明乳业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：