本发明专利技术提供一种结核分枝杆菌特异性标志物Rv1284的重组蛋白，其具有如SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列。本发明专利技术还提供所述结核分枝杆菌Rv1284重组蛋白的编码核苷酸序列、所述重组蛋白的制备方法及其用途。本发明专利技术基于免疫组学的研究成果，首次报道了结核菌分泌蛋白Rv1284可以应用于结核病诊断，且是一个强免疫活性的结核病标志物，用于结核病免疫学诊断，具有较高的敏感性高，且更为简便、快速和安全可靠。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药体外诊断试剂领域，特别涉及一种结核分枝杆菌特异性标志物Rvl284重组蛋白、其制备方法及其在结核免疫诊断中的应用。
技术介绍
开发简便、快速和准确可靠的诊断结核分枝杆菌(MTB)感染，对于结核病的控制具有重要意义。目前MTB感染的诊断方法有很多，但临床最为常用的方法仍然依靠传统的痰涂片细菌学检查，但检出率低；MTB培养可做为结核病确诊的“金标准”，但其培养时间太长，一般4-6周，难以满足临床需要；Bactec技术虽缩短了培养时间，但费用较高，短时间内难以推广普及；X线和CT检查仅提供影像学可能性诊断；聚合酶链反应(PCR)技术及其它基因诊断方法作为临床诊断尚存在操作复杂，对技术和人员专业素质要求较高，且仍不能用于菌阴结核病的快速诊断。而MTB感染的血清免疫学诊断以其固有的操作简便、快速、可用肉眼判断结果、稳定性好、便于推广、无需特殊精密仪器等优势，是迄今最可能满足经济不发达地区和结核病高发区所亟需的结核病诊断技术。
技术实现思路
为克服现有技术中的上述问题，本专利技术的一个目的是提供一种结核分枝杆菌Rv1284重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，通过使用pET32a质粒，在Rvl284该天然蛋白序列前面加了一段Trx Taq和S Taq融合标签及His Tag纯化标签。所述Trx Taq和S Taq融合标签及His Tag纯化标签的氨基酸序列由SEQ IDNO: I中从氨基末端第I至第165位氨基酸残基序列组成。SEQ ID NO: I中从氨基末端第166至第313位氨基酸残基序列组成天然Rvl284蛋白氨基酸序列。本专利技术的另一个目的是提供一种编码上述的Rvl284重组蛋白的核苷酸序列，其具有选自下列C)、d)或e)的核苷酸序列c) SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；d)不同于SEQ ID NO: 2但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO: 2所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；e)在严格杂交条件下与上述c)或d)中的序列杂交，并且编码具有所述Rvl284重组蛋白活性的核苷酸序列。本专利技术的另一个目的在于提供所述的结核分枝杆菌Rvl284重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(I)制备结核分枝杆菌菌株基因组DNA ；(2)扩增 Rvl284 基因;(3) Rv1284基因插入表达质粒；(4)将构建的表达质粒转化入宿主细胞；(5)诱导表达蛋白Rvl284 ；(6)分离纯化诱导表达产物，得到Rvl284重组蛋白，其中，在制备结核分枝杆菌Rvl284基因中采用的引物为Rvl284-F和Rvl284-R，所述引物Rvl284-F的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，所述引物Rvl284_R的核苷酸序列如SEQ ID No:4 所示。本专利技术的再一目的在于提供所述结核分枝杆菌Rvl284重组蛋白或所述Rv1284重组蛋白的基因引物在制备检测或诊断结核病的试剂中的应用。所述Rv3120重组蛋白的基因引物为Rvl284-F和Rvl284-R，Rvl284_F的核苷酸序列为如SEQ IDNo: 3 (TAGGATCCAGCGGTTTCAAGGGC)所示，Rvl284_R 的核苷酸序列为如 SEQ ID No:4(ATTCTCGAGGGGCGTGACCTCGTTG)所示。 本专利技术的再一目的在于提供结核分枝杆菌Rvl284重组蛋白、其特异性抗体或所述Rvl284重组蛋白的基因引物在制备结核病检测试剂盒中的应用。所述Rv3120重组蛋白的基因引物为Rvl284-F和Rvl284-R，Rvl284_F的核苷酸序列为如SEQ IDNo: 3 (TAGGATCCAGCGGTTTCAAGGGC)所示，Rvl284_R 的核苷酸序列为如 SEQ ID No:4(ATTCTCGAGGGGCGTGACCTCGTTG)所示。本专利技术的再一目的在于提供一种结核病检测试剂盒，其组分中的检测抗原是所述结核分枝杆菌Rvl284重组蛋白。本专利技术的另一个目的是提供一种新型结核诊断试剂，其含有所述结核分枝杆菌Rv 1284重组蛋白。本专利技术的再一个目的是提供上述试剂的制备方法。本专利技术的一个方面，提供了一种包含所述结核分枝杆菌Rvl284基因的重组质粒，即将Rvl284基因序列插入商用表达质粒序列中。Rvl284基因NCBI登陆号为BX842576. I ；蛋白号为CAA97750. I。本专利技术的“Rvl284基因序列”也包括对BX842576. I中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与BX842576. I核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码相同的氨基酸序列。该术语还包括在中度严密条件下，更佳地在高度严密条件下与BX842576. I的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与BX842576. I的核苷酸序列同源性至少70%，更佳地至少90%的核苷酸序列。本专利技术的重组质粒，通常将Rvl284基因插入表达质粒的多克隆位点处得到。本专利技术的重组质粒在制备过程中，可选用本领域已知的各种载体，然后将编码本专利技术的核苷酸序列可操作性地连接于表达调控序列，从而形成蛋白表达载体。本专利技术中可采用的载体有pET32a等。本专利技术的一个实施例中，所用的质粒为pET32a。本专利技术的另一方面，提供了一种结核分枝杆菌相关重组蛋白，该蛋白是将插入Rvl284基因的重组表达质粒转入宿主细胞而得到的。用作检测试剂的Rvl284重组蛋白与NCBI上的CAA97750. I蛋白序列相比，加入了载体相关序列和纯化标签。例如，使用pET32a质粒时,蛋白序列如面加了 pET32a上的相关序列和一段His Tag纯化标签。所用的宿主细胞应当与表达质粒相匹配。可使用原核细胞或者真核细胞等，例如常用的大肠杆菌(E. coli)。用于转化的宿主细胞可以是BL21 (DE3)或BL21 plysS (DE3)菌株等。本专利技术的一个实施例中所用的就是BL21 plysS (DE3)菌株。本专利技术的另一方面，提供了上述结核分枝杆菌相关蛋白的制备方法，包括以下步骤(I)结核分枝杆菌菌株基因组DNA的制备；(2) Rv1284 基因的扩增；(3) Rv1284基因插入表达质粒；(4)将构建的表达质粒转化入宿主细胞；(5)诱导表达蛋白Rvl284 ； (6)分离纯化诱导表达产物，得到Rvl284重组蛋白。上述制备方法中，各种实验参数均按常规操作选择，可视具体实验条件而定。本专利技术的Rvl284基因序列可以用PCR扩增法获得。可根据本专利技术所公开的相关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用本领域技术人员已知的常规方法所制备的基因组DNA为模板，扩增而得到相关序列。本专利技术中，重组蛋白所用的表达质粒可以是pET32a等。本专利技术的一个实施例中，重组蛋白Rvl284按如下方法得到设计引物Rvl284-F (SEQ ID No:3) :TAGGATCCAGCGGTTTCA AGGGC;Rvl284-R (SEQ ID No:4) :ATTCTCGAGGGGCGTGACCTCGTTG ；以H37Rv株基因组DNA为模板，PCR扩增Rvl284基因，该基因的PCR产物经纯化后双酶切，克隆构本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种结核分枝杆菌RV1284重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，通过使用pET32a质粒,在Rvl284该天然蛋白序列前面加了一段Trx · Taq和S · Taq融合标签及His · Tag纯化标签。2.根据权利要求I所述的Rvl284重组蛋白，其特征在于,所述Trx· Taq和S · Taq融合标签及His · Tag纯化标签的氨基酸序列由SEQ ID NO: I中从氨基末端第I至第165位氨基酸残基序列组成。3.一种编码权利要求I或2所述的Rvl284重组蛋白的核苷酸序列，其特征在于具有选自下列C)、d)或e)的核苷酸序列 c)SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列； d)不同于SEQID NO: 2但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO: 2所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列； e)在严格杂交条件下与上述c)或d)中的序列杂交，并且编码具有所述Rvl284重组蛋白活性的核苷酸序列。4.一种包含权利要求3所述结核分枝杆菌Rvl284基因的重组质粒。5.根据权利要求I或2所述的结核分枝杆菌Rvl284重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)制备结核分枝杆菌菌株基因组DNA； (2)扩增Rvl284基因； (3)Rv1284基因插入表达质粒； (4)将构建的表达质粒转化...
【专利技术属性】
技术研发人员：张舒林，张湘燕，孙战强，赵俊伟，郭晓奎，王洪海，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
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