本发明专利技术公开了一种去甲肾上腺素（NE）完全抗原的制备方法及偶联摩尔比测定方法，解决了现有去甲肾上腺素是小分子结构，激发不了动物机体产生抗体的问题，技术方案包括将NE与载体偶联、纯化、同时制备载体mannich对照，并通过紫外分光光度计对载体、载体mannich对照、NE标准品及偶联物在200-500nm之间进行扫描，并进行图形化比对，判定偶联是否成功，并进一步通过摩尔消光系数法计算NE与载体载体的偶联摩尔比。本发明专利技术方法能生产出高品质的完全抗原，具有方法简单、生产周期短，生产成本低的优点，适用于NE的免疫学检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫学
，具体的是说一种去甲肾上腺素(以下简称NE)完全抗原的制备方法以及测定去甲肾上腺素完全抗原中NE与载体的偶联摩尔比的方法。
技术介绍
去甲肾上腺素(Norepinephrine,也称Noradrenaline,缩写NE或NA),旧称“正肾上腺素”，学名1_(3，4-二羟苯基)-2-氨基乙醇，是肾上腺素去掉N-甲基后形成的物质，在化学结构上也属于儿茶酚胺。它既是一种神经递质，主要由交感节后神经元和脑内肾上腺素能神经末梢合成和分泌，是后者释放的主要递质；也是一种激素，由肾上腺髓质合成和分泌，但含量较少。多巴、多巴胺、肾上腺素与去甲肾上腺素等统称为儿茶酚胺类物质，它们都是由酪 氨酸衍生而来的系列物。儿茶酚胺作为神经递质和激素，与人们的健康与疾病有密切关系，它们不仅直接参与行为活动以及参与血压、心率、呼吸和睡眠等植物神经功能的调控，而且还与一些功能性疾病如神经分裂症、忧郁症以及器质性病变的出现有关。血浆及尿中儿茶酚胺的浓度水平可用于诊断高血压、嗜铬细胞瘤及成神经细胞瘤等病症，因而准确测定人体生物样品中儿茶酚胺类物质代谢浓度的变化，在疾病的诊断和治疗中具有重要的意义。目前，人体液和组织中儿茶酚胺类物质的不同分析方法，包括高效液相色谱法、毛细管电泳法、质谱法、电化学法、化学发光法、荧光光度法等。NE的免疫学检测方法不仅方法简便，成本低廉，不需要高精密的仪器，而且检测的灵敏度都不亚于高效液相色谱法；但建立高效免疫学检测方法的关键是需要高品质的抗体，高品质抗体的前提是制备免疫原型较强的完全抗原，而众所周知，NE是小分子结构，激发不了动物机体产生抗体，因此，研究人员需要提供一种简单可靠的方法，以获得一种能够高效激发动物机体产生抗体的完全抗原。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述技术问题，提供一种制备方法简单、生产周期短，生产成本低的用于NE的免疫学检测方法的免疫原型强的完全抗原。技术方案包括下述步骤，(I)将NE与载体分别溶于NaAc溶液中，分别制备NE溶液及载体溶液，然后将两者混合后加入甲醛溶液并调节PH值在6. 0 — 6. 5 (优选6)之间，4°C持续搅拌下进行偶联反应20 — 28小时(优选24小时)，得到反应混合液。(2)反应混合液通过超滤、透析或者脱盐柱法除去反应混合液中未偶联上的小分子物质，缓冲液采用pH为7. 2的0. OlM磷酸盐缓冲液(PBS)，得到偶联物。(3)按照步骤(I)和步骤(2)的方法，反应体系缺失NE，维持其他各反应条件不变的条件下，制得载体mannich对照。(4)采用紫外分光光度计对载体、载体mannich对照、NE标准品及偶联物在200-500nm之间进行扫描，在同坐标上进行图形比对，在偶联物与载体mannich对照蛋白浓度相同的情况下，如果偶联物比载体mannich对照多出特征吸收峰，则判定偶联成功，即得到NE完全抗原。 所述步骤(I)中，所述载体为含有游离氨基的生物大分子，具体为牛血清白蛋白或卵清白蛋白或血蓝蛋白。所述步骤(I)中，将NE与载体分别溶于I. 2mol/L NaAc溶液中，分别制备34mmoL/L NE溶液和3. 4mmoL/L载体溶液，按照NE与载体摩尔比10-20 :1(优选10 :1)的比例，将NE溶液缓慢加入到载体溶液 中，缓慢滴加，边滴加边搅拌，混匀后制成混合溶液，然后在搅拌下缓慢滴加与混合溶液等体积的体积浓度为3%甲醛溶液，滴加完以后，用I. 2mol/L NaAc溶液调节PH值在6. 0-6. 5之间，4°C持续搅拌，反应20 — 28小时，得到反应混合液。所述将NE溶液缓慢加入到载体溶液中，滴加速度为1-2毫升/分，边滴加边搅拌，搅拌速度为100-150转/分。所述在搅拌下缓慢滴加与混合溶液等体积的体积浓度为3%甲醛溶液，搅拌速度为100-150转/分，滴加速度为1-2毫升/分。通过摩尔消光系数法计算NE完全抗原中NE与蛋白载体的偶联摩尔比，首先，采用紫外分光光度扫描得到NE完全抗原在200-500nm之间两个特征吸收峰为入I和X 2，其中入I为载体的特征吸收峰，X 2为NE完全抗原特有的吸收峰，公式如下[Ane完全抗原入i/ NE入2]/[( Ane完全抗原入「Ane完全抗原入2 X NEA l/ NE入2)/ 载体入J其中，Ane完全_ A2 NE完全抗原在\ 2的吸光度；Ane完全_ A1 NE完全抗原在\ I的吸光度；NEA2 :NE在入2处的摩尔消光系数；NEA1 :NE在入I处的摩尔消光系数；载体A2 :载体在入2处的摩尔消光系数；S#A1 :载体在入I处的摩尔消光系数。mannich法的原理是含有a -活泼氢的醛、酮与甲醛及胺(伯胺、仲胺或氨)反应，结果一个a -活泼氢被胺甲基取代，此反应又称为胺甲基化反应，所得产物称为Mannich碱(见图I)。专利技术人依据mannich法的原理和NE的结构特征,运用mannich法将NE与载体偶联，制备完全抗原(图2)。基于上述原理，进一步的，为了达到高效偶联，专利技术人对NE与载体的偶联工艺进行了设计，NE与载体摩尔比控制在10-20:1为好，过高则干扰偶联反应的动态平衡，后期去除也比较困难，过低则影响偶联效果和偶联的摩尔比；并且NE溶液和载体溶液的混合过程以缓慢滴加并配合搅拌的方式为好，这样可以避免反应物聚集沉淀问题的发生，同理，在NE溶液和载体溶液混合后，再在搅拌下缓慢滴加甲醛溶液，是为了防止三者同时混合而出现的局部反应不均匀的，造成反应产物聚集沉淀的问题。所述偶联反应应该在低温下进行，优选为4°C，且应该保持搅拌速度在100-150转/分。通过控制上述偶联反应的工艺条件，并且再经过超滤、透析或者脱盐柱法除去反应混合液中未偶联上的小分子物质(如未偶联上的NE、甲醛、NaAc等小分子物质)，从而达到纯化偶联物的目的，可以得到高纯度、高品质完全抗原，从而达到高效激发动物机体产生抗体的目的。所述超滤、透析或者脱盐柱法均为现有技术，具体方法可参见所使用具体产品的操作手册。紫外分光光度计能够快速准确的判定偶联是否成功，但出于希望制备高品质的完全抗原考虑，希望NE与载体的偶联比尽可能的高，此时就需要一种能够测定偶联物中NE与载体的偶联比的方法，专利技术人特别采用摩尔消光系数法计算NE与蛋白载体的偶联摩尔比，通过预先获得X I和X 2，再带入公式计算，即可得到偶联摩尔比。有益效果(I)本专利技术方法制备完全抗原步骤简单、方法易于操作，解决了小分子结构的NE难以制备完全抗原，无法激发动物机体产生抗体的问题。(2)由本专利技术方法制备得到的完全抗原品质高(偶联物的偶联尔摩尔比可达4:1以上),免疫动物后从而激发动物产生高品质的抗体。(3)可以明确鉴定完全抗原合成是否成功，并精确计算小分子与载体的偶联比，便于制备高品质抗体过程中的质量控制。附图说明图l.Mannich反应原理示意图；图2.载体与去甲肾上腺素(NE)偶联示意图；图3.分光光度计连续波长扫描载体牛血清白蛋白(以下简称BSA)、BSA mannich对照、NE和NE完全抗原I (BSA — NE)在200_500nm之间吸收峰图；图4.分光光度计连续波长扫描载体卵清蛋白(以下简称OVA)、OVA mannich对 照、NE本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种去甲肾上腺素完全抗原的制备方法，其特征在于，包括下述步骤， (1)将去甲肾上腺素与载体分别溶于NaAc溶液中，分别制备NE溶液及载体溶液，然后将两者混合后加入甲醛溶液并调节PH值为6. O — 6. 5后，4°C持续搅拌下进行偶联反应20 - 28小时，得到反应混合液。(2)反应混合液通过超滤、透析或者脱盐柱法除去反应混合液中未偶联上的小分子物质，缓冲液采用pH为7. 2的0. OlM磷酸盐缓冲液，得到偶联物。(3)按照步骤I和步骤2的方法，反应体系缺失去甲肾上腺素，维持其他各反应条件不变的条件下，制得载体mannich对照。(4)采用紫外分光光度计对载体、载体mannich对照、去甲肾上腺素标准品及偶联物在200-500nm之间进行扫描，在同坐标上进行图形比对，在偶联物与载体mannich对照浓度相同的情况下，如果偶联物比载体mannich对照多出特征吸收峰，则判定偶联成功，即得到去甲肾上腺素完全抗原。2.如权利要求I所述的去甲肾上腺素完全抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中，所述载体为含有游离氨基的生物大分子，具体为牛血清白蛋白或卵清白蛋白或血蓝蛋白。3.如权利要求I或2所述的去甲肾上腺素完全抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中，将去甲肾上腺素与载体分别溶于I. 2mol/L NaAc溶液中，分别制备34mmoL/L去甲肾上腺素溶液和3. 4mmol/L载体溶液，按照去甲肾上腺素与载体摩尔比10-20 1的比例，将去甲肾上腺素溶液缓慢加入到载体溶液中，缓慢滴加，边滴加边搅拌，混匀后制成混合溶液，然后在搅拌下缓慢滴加与混合溶液等体积的体积浓度为3%...
【专利技术属性】
技术研发人员：鲁亮，费小战，周琪，李学斌，
申请(专利权)人：武汉伊艾博科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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