本发明专利技术公开了一种分离、培养一类原始干细胞亚群的制备工艺，涉及一种原始干细胞亚群用于治疗心血管损伤的方法。从骨髓中分离、培养的一类原始干细胞亚群，细胞表型是CD29、CD44、CD105、Flk-1阳性，诱导原始干细胞亚群分化为心血管组织，涉及原始干细胞亚群的分离、培养，在体外经诱导因子诱导培养而分别表达心肌细胞和血管内皮细胞的特异性细胞表面标志和相关抗原分子。在体内标记的原始干细胞亚群诱导后检测出同样的阳性结果，并分化成有功能性的心肌和血管内皮细胞。对急性心肌梗死患者PCI术后自体原始干细胞亚群行冠脉内注射，比较对照组检测表明患者心功能及预后明显改善。这就为心血管损伤，特别是治疗急性心肌梗塞提供了新途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及原始干细胞亚群分离培养及诱导的有效方法，并涉及首次利用5-氮胞杂苷诱导骨髓原始干细胞亚群向心肌细胞分化，利用血管内皮生长因子VEGF-B诱导原始干细胞亚群向血管内皮细胞分化，并应用于体内治疗急性心肌梗塞。
技术介绍
目前，我国己经进入老龄化社会，心血管疾病的发病率、致死率呈逐年上升趋势，心血管疾病成为人类三大死亡原因之一。现在临床上对其进行治疗的药物、介入和手术等常用方法较难纠正已经坏死和衰老的心血管组织，而心血管组织自身修复能力有限。替代治疗为另一种治疗策略，分为器官移植和细胞移植。由于器官来源不足、免疫排斥、费用高昂，严重限制了器官移植的应用。干细胞具有自我更新和多分化能力，为细胞移植的理想细胞，其中，骨髓原始干细胞亚群由于其易获得、扩增等诸多优点，成为首选种子细胞。本专利技术在国际上首次将骨髓原始干细胞亚群分别在体外和体内诱导分化为心肌和血管内皮细胞，并建立了原始干细胞亚群分离培养及诱导的有效方法，为用于细胞移植以治疗心血管疾病，特别是急性心肌梗塞提供了新的途径。
技术实现思路
本专利技术建立了原始干细胞亚群分离培养及诱导的有效方法，涉及首次利用5-氮胞杂苷诱导骨髓原始干细胞亚群向心肌细胞分化，利用血管内皮生长因子VEGF-B诱导原始干细胞亚群向血管内皮细胞分化，并应用于体内治疗急性心肌梗塞。从骨髓中分离、培养的原始干细胞亚群是一类亚全能干细胞，具有分化为心血管组织的潜能。体外经诱导的原始干细胞亚群表达肌凝蛋白重链和肌钙蛋白I，表达VIII因予相关抗原和⑶31。在体内标记的原始干细胞亚群表达阳性的肌凝蛋白重链和VIII因子相关抗原，分化为心肌和血管内皮细胞。对急性心肌梗死患者PCI术后自体原始干细胞亚群行冠脉内注射，比较对照组检测表明患者心功能及预后明显改善。这就为心血管再生医学提供理想种子细胞，为治疗心血管疾病，特别是治疗急性心肌梗塞提供了新方法。具体而言，本专利技术涉及原始干细胞亚群在制备用于治疗心血管疾病的药物中的用途。特别地，本专利技术所述用途中所使用的原始干细胞亚群是按下述步骤获得的一类原始干细胞亚群a)从骨髓中分离出单个核细胞，和b)用扩增培养液进行培养，其中扩增培养液含有胎牛血清和抗坏血酸，且其细胞表型为⑶29、⑶44、⑶105和Flk-I阳性。特别地，在本专利技术所述的用途中，利用5-氮胞杂苷分别诱导所述原始干细胞亚群在体外和体内向心肌细胞分化，经免疫荧光检测出诱导的细胞表面表达心肌细胞特异性的表面标志分子和相关抗原，体外经诱导的原始干细胞亚群表达肌凝蛋白重链和肌钙蛋白I;在体内标记的原始干细胞亚群表达阳性的肌凝蛋白重链，分化为有功能的心肌细胞。相似地,利用血管内皮生长因子VEGF-B分别诱导所述原始干细胞亚群在体外和体内向血管内皮细胞分化，经免疫荧光检测诱导的细胞表面表达血管内皮细胞特异性的表面标志分子和相关抗原，体外经诱导的原始干细胞亚群表达VIII因子相关抗和CD31 ;在体内标记的原始干细胞亚群表达阳性的VIII因子相关抗原，分化为血管内皮细胞。特别地，在本专利技术所述的用途中，所述心血管疾病是先天性或获得性、心血管疾病引起的心肌及血管缺损，特别是急性心肌梗塞。本专利技术的优点在于·I.本专利技术报道了骨髓原始干细胞亚群的分离、培养和扩增过程，操作方法简单可行；2.本专利技术首次报道骨髓原始干细胞亚群在体内和体外分别诱导分化为心肌细胞和血管内皮细胞的过程，并证明了骨髓原始干细胞亚群胞分化为心血管组织的潜能；3.本专利技术确定了骨髓原始干细胞亚群诱导分化为心血管组织的检测方法，细胞形态及功能性证明，这就为干细胞及组织工程应用研究提供了标准审核的基础；4.本专利技术为治疗心血管疾病，特别是急性心肌梗塞提供了实验依据和临床研究依据，为细胞移植治疗提供了新的途径。附图说明图I :显示了原始干细胞亚群的免疫表型和细胞周期A免疫表型；B细胞周期。图2 :显示了原始干细胞亚群体外分化为心血管组织。A诱导为心肌细胞al诱导前；a2四周后；a3抗心肌凝蛋白重链-FITC ;a4抗心肌肌钙蛋白I-PE ；B诱导为血管内皮细胞bl诱导前；b2 二周后；b3抗vWF-FITC ；b4抗CD31-PE图3 :显示了心脏冰冻切片中PKH26荧光检测。图4 :显示了原始干细胞亚群体内分化为心血管组织。A al抗心肌凝蛋白重链-FITC ；a2抗fcdU_PE ；a3al和a2的合并B bl 抗 vWF-FITC ；b2 抗 fcdU-PE ；b3bl 和 b2 的合并图5 :显示了两组的心肌核素检查。图6 :显示了原始干细胞亚群的PKH26荧光和BrdU标记。A原始干细胞亚群注射前的PKH26荧光标记B心肌组织中PKfi26荧光显色C Cl为培养的原始干细胞亚群经BrdU标记后的免疫荧光显色；C2为培养的原始干细胞亚群的光镜观；C3为Cl和C2的合并7 :显示了心肌组织的免疫荧光显色。A红色为抗心肌凝蛋白重链的PE显色，绿色为抗BrdU的FITC显色B红色为BrdU的PE显色，绿色为抗连接蛋白43的FITC显色C红色为BrdU的PE显色，绿色为抗vWF的FITC显色D红色为BrdU的PE显色，绿色为抗平滑肌肌动蛋白的FITC显色图8 :显示了两组间左室压力检测结果比较。图9 :显示了两组患者基线及3月随访超声心动图、核素之间指标比较。具体实施例方式本专利技术具体涉及一种分离，培养一类原始干细胞亚群的制备工艺，涉及一种原始干细胞亚群用于治疗心血管损伤的方法。其特征在于细胞表型是⑶29、⑶44、⑶101、Flk-I阳性，诱导原始干细胞亚群分化为心 血管组织，涉及原始干细胞亚群的分离、培养，在体外经诱导因子诱导培养而分别表达心肌细胞和血管内皮细胞的特异性细胞表面标志和相关抗原分子。在体内标记的原始干细胞亚群诱导后检测出同样的阳性结果，并分化成有功能性的心肌和血管内皮细胞。对急性心肌梗死患者PCI术后自体原始干细胞亚群行冠脉内注射，比较对照组检测表明患者心功能及预后明显改善。这就为心血管损伤，特别是治疗急性心肌梗塞提供了新途径。本专利技术的另一个方面涉及一类干细胞亚群的制备工艺，其特征在于从骨髓中分离出单个核细胞，用扩增培养液进行培养，从而获得了一类原始干细胞亚群。如扩增培养液含有胎牛血清、抗坏血酸等。特别地，本专利技术的一个方面具体涉及心肌细胞诱导方法，其特征在于在体外和体内分别利用5-氮胞杂苷诱导原始干细胞亚群向心肌细胞分化。经免疫荧光检测出诱导的细胞表面表达心肌细胞特异性的表面标志分子和相关抗原尿，如体外经诱导的原始干细胞亚群表达肌凝蛋白重链和肌钙蛋白I ;在体内标记的原始干细胞亚群表达阳性的肌凝蛋白重链，分化为有功能的心肌细胞。特别地，本专利技术的一个方面具体涉及血管内皮细胞诱导方法，其特征在于在体外和体内分别利用血管内皮生长因子VEGF-B诱导原始干细胞亚群向血管内皮细胞分化。经免疫荧光检测诱导的细胞表面表达血管内皮细胞特异性的表面标志分子和相关抗原，如体外经诱导的原始干细胞亚群表达VIII因子相关抗和⑶31。在体内标记的原始干细胞亚群表达阳性的VIII因子相关抗原，分化为血管内皮细胞。特别地，本专利技术的一个方面涉及一种应用于心血管疾病的治疗干细胞亚群的制备工艺，其特征在于对急性心肌梗死患者行自体原始干细胞亚群冠脉内注射治疗，和未使用原始本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.原始干细胞亚群在制备用于治疗心血管疾病的药物中的用途。2.根据权利要求I所述的用途，其特征在于所述原始干细胞亚群是按 下述步骤获得的一类原始干细胞亚群 a)从骨髓中分离出单个核细胞，和 b)用扩增培养液进行培养， 其中扩增培养液含有胎牛血清和抗坏血酸。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述原始干细胞亚群的细胞表型是CD29、CD44、CD105 和 Flk-I 阳性。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于利用5-氮胞杂苷分别诱导原始干细胞亚群在体外和体内向心肌细胞分化，经免疫荧光检测出诱导的细胞表面表达心肌细胞特异性的表面标志分子和相关抗原，体外诱导的原始干细胞亚群表达肌凝蛋白重链...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵春华，
申请(专利权)人：河北贝特赛奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。