一种体外抗小鹅瘟转移因子的制备方法技术

本发明专利技术公开一种体外抗小鹅瘟病毒转移因子的制备方法，利用体外淋巴细胞培养方式，经过小鹅瘟病毒的诱导制备抗小鹅瘟转移因子。本发明专利技术是以鹅脾脏或外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经植物血凝素和小鹅瘟病毒诱导培养单层淋巴细胞，从而促进体外产生大量抗小鹅瘟病毒特异转移因子。该转移因子能够有效的抑制抗小鹅瘟病毒,使正常的机体免受抗小鹅瘟疾病的感染，起到根本的预防作用,提高机体的免疫力。本发明专利技术方法具有简单、易操作等特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于免疫学领域。
技术介绍
小鹅瘟是由小鹅瘟病毒(GPV)引起的雏鹅和雏番鸭一种急性或亚急性的败血症，小肠发生急性卡他性或纤维素坏死性炎症，主要侵害4-20日龄雏鹅，传染快、发病率与死亡率都高，给养殖业带来重大损失。本病是1956年由我国方定一在扬州发现，1965年来，欧洲很多国家报道有本病的存在。转移因子(TF，Transfer Factor)又称传输因子，可以作为细胞免疫促进剂，是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的低分子量多肽-核苷酸复合物，这种物质将供体 的某种特定的细胞免疫功能特异地转移给受体正常的淋巴细胞，参与机体的免疫反应，提高受体的细胞免疫功能；同时促进B淋巴细胞分泌作用，能够诱导免疫细胞释放干扰素和白介素，从而增强受体的抵抗力，这种转移因子分子量小、无毒、活性强、无抗原性、不起过敏反应等优点，对于治疗动物病毒性疾病、细胞免疫减弱或缺陷病以及恶性肿瘤、真菌性疾病时，可以起辅助治疗作用。目前已经有一些抗小鹅瘟的药品和制剂，但由于现有的药品制剂针对性不强，疗效有限，而且治疗性的制剂多是在发病之后才应用的，不能起到根本的治疗作用。目前已报道的转移因子的提取方法大多关于非特异性转移因子的制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术所采用的技术方案如下，以鸡脾脏或 外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经植物血凝素(Phytohemagglutinin, PHA)和鸭肝炎病毒诱导培养单层淋巴细胞，从而促进体外产生大量抗小鹅瘟病毒特异转移因子，具体步骤如下 1)淋巴细胞的制备首先选择健康鸡，在无菌的条件下采取鸡脾脏或抗凝血，制成单层淋巴细胞； 2)淋巴细胞的培养单层淋巴细胞进行传代培养，以单层形式传代，备用； 3)病毒的接种将小鹅瘟病毒接种于12-14日龄鹅胚的绒尿腔中，37°C培养72-120h增殖病毒，将尿囊液收集，然后经过超声波破碎处理后离心，留沉淀，根据病毒的粒子大小利用密度梯度高速离心，得到较为纯病毒；4)经过植物血凝素和小鹅瘟病毒诱导培养单层淋巴细胞，即得抗小鹅瘟病毒转移因子。步骤I)所述鸡脾细胞制备过程中胰酶浓度要求O. 2-0. 25%，pH为7. 2-7. 5，用量为组织体积量的6-8倍。步骤4)所述促进鸡脾脏细胞或血淋巴细胞分化增殖的植物凝血素使用浓度为60_180mg/L。本专利技术是关于小鹅瘟病毒特异性转移因子的制备方法，小鹅瘟病毒不仅感染雏鹅，同样感染雏番鸭，制备生产出相应的转移因子对于预防本疾病的发生提供保障。本专利技术采用的体外制备方法，这样减少了生物个体因素的影响，这样在临床使用时减少了对机体不必要应激反应，同时起到应有的效应。本专利技术的制备方法简单、易操作、生产成本低等特点。具体实施例方式结合具体实施例对本专利技术的内容作进一步的说明。实施例I 一种体外抗小鹅瘟病毒转移因子的制备方法，本实施例是以鸡外周血液为基础原料， 制备单层淋巴细胞，经植物血凝素和小鹅瘟病毒诱导培养单层淋巴细胞，从而促进体外产生大量抗小鹅瘟病毒特异转移因子，具体步骤如下 1.抗凝血的采集选择健康无传染病鸡，采血部位消毒，用50mL的无菌注射器，心脏采集抗凝血，加入浓度为lmg/mL的肝素钠5mL ； 2.淋巴细胞分离抗凝血与淋巴细胞分离液(购北京普利生物试剂有限公司，按使用说明操作)按I :1的比例加入消毒后的离心管中，淋巴细胞分离液加到离心管的底部，3000r/min离心15min,收集中间的白色层，然后用pH7. O的Hanks液反复清洗淋巴细胞3次，5000r/min，离心lOmin，收集沉淀，用含30%的犊牛血清DMEM (购买InvitrogenCorporation,按使用说明操作)80mL充分混勻,然后分装于IOOmL的细胞培养瓶中，置于5% C02，37°C恒温箱中培养，经3天的培养，淋巴细胞贴壁生长形成单层； 3.淋巴细胞的培养单层淋巴细胞进行传代培养，首先将长成单层淋巴细胞层用O.2%的胰酶37°C短时间消化，吹打分散，加入Hanks液终止，再洗2遍，取1/3加入到干净培养瓶，5% C02，37°C恒温培养，每天观察一次，长成单层为止； 4.病毒的接种将小鹅瘟病毒接种于12日龄鹅胚的绒尿腔中，37°C培养72h增殖病毒，将尿囊液收集，然后经过超声波破碎处理后离心，留沉淀，根据病毒的粒子大小利用密度梯度高速离心，得到较为纯病毒； 5.诱导培养当单层淋巴细胞长成后，更换成维持液(含5%犊牛血清DMEM)，同时加入浓度为60mg/L的植物血凝素，小鹅瘟病毒(浓度为640血凝单位/mL)进行诱导培养，经过2天的诱导培养，然后将细胞瓶经过微振荡，将培养液移置于离心管中离心，收集上清液； 6.转移因子的制备上清液利用超声波细胞破碎仪(工作状态破碎3s停3s，300W，10min)破碎后，离心取上清，经O. 22um滤膜过滤，滤液经过截留分子量为6000道尔顿的中空纤维膜超滤，利用正向压力超滤，收集滤液再次过滤除菌，分装，即为抗小鹅瘟病毒转移因子。实施例2 一种体外抗小鹅瘟病毒转移因子的制备方法，本实施例是以鸡外周血液为基础原料，制备单层淋巴细胞，经植物血凝素和小鹅瘟病毒诱导培养单层淋巴细胞，从而促进体外产生大量抗小鹅瘟病毒特异转移因子，具体步骤如下1.抗凝血的采集选择健康无传染病鸡，采血部位消毒，用50mL的无菌注射器，心脏采集抗凝血，加入浓度为lmg/mL的肝素钠5mL ； 2.淋巴细胞分离抗凝血与淋巴细胞分离液(购北京普利生物试剂有限公司，按使用说明操作)按I :1的比例加入消毒后的离心管中，淋巴细胞分离液加到离心管的底部，2500r/min离心20min,收集中间的白色层，然后用pH7. 2的Hanks液反复清洗淋巴细胞4次，4000r/min，离心lOmin，收集沉淀，用含30%的犊牛血清DMEM (购买InvitrogenCorporation,按使用说明操作)80mL充分混勻，然后分装于IOOmL的细胞培养瓶中，置于5% C02，37°C转瓶机中培养，经4天的培养，淋巴细胞贴壁生长形成单层； 3.淋巴细胞的培养单层淋巴细胞进行传代培养，首先将长成单层淋巴细胞层用O.2%的胰酶37°C短时间消化2 min,吹打分散，加入Hanks液终止，再洗3遍，取1/3加入到干净培养瓶，5% C02，37°C恒温培养，每天观察一次，长成单层为止； 4.病毒的接种将小鹅瘟病毒接种于13日龄鹅胚的绒尿腔中，37°C培养96h增殖病 毒，将尿囊液收集，然后经过超声波破碎处理后离心，留沉淀，根据病毒的粒子大小利用密度梯度高速离心，得到较为纯病毒； 5.诱导培养当单层淋巴细胞长成后，更换成维持液(含5%犊牛血清DMEM)，同时加入浓度为100mg/L的植物血凝素，小鹅瘟病毒(浓度为1280血凝单位/mL)进行诱导培养，经过4天的诱导培养，然后将细胞瓶经过微振荡，将培养液移置于离心管中离心，收集上清液； 6.转移因子的制备上清液利用超声波细胞破碎仪(工作状态破碎3s停3s，300W，10min)破碎后，离心取上清，经0. 22um滤膜过滤，滤液经过截留分子量为6000道尔顿的中空纤维膜超滤，利用正向压力超滤，收集滤液再次过滤除菌，分装，即为抗小鹅瘟本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外抗小鹅瘟病毒转移因子的制备方法，其特征在于以鸡脾脏或外周血液为基 础原料，制备单层淋巴细胞，经植物血凝素和抗小鹅瘟病毒诱导培养单层淋巴细胞，从而促进体外产生大量抗小鹅瘟病毒特异转移因子，具体步骤如下 1)淋巴细胞的制备首先选择健康鸡，在无菌的条件下采取鸡脾脏或抗凝血，制成单层淋巴细胞； 2)淋巴细胞的培养单层淋巴细胞进行传代培养，以单层形式传代，备用； 3)病毒的接种将小鹅瘟病毒接种于12-14日龄鹅胚的绒尿腔中，37°C培养72-120h增殖病毒，将尿囊液收集，然后经过超声波破碎处理...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴红云，郭俊清，万升，
申请(专利权)人：郑州后羿制药有限公司，
类型：发明
国别省市：