多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒制造技术

多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒，涉及一种多房棘球绦虫循环抗原检测试剂。设有检测板、金标记抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体和洗涤液，检测板设有载体介质、微孔滤膜、吸水介质、多房棘球绦虫循环抗原检测点和对照点；多房棘球绦虫循环抗原检测点和对照点依次设在微孔滤膜上；在多房棘球绦虫循环抗原检测点处包被抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体，在对照点处包被多房棘球绦虫抗原EM2和EM18，微孔滤膜固定于吸水介质上并放入载体介质内，载体介质一侧开有与微孔滤膜相对的通孔。检测时，所需的标本量极小，不需要特殊仪器，肉眼直接判读结果，且检测简便快速，特异性强，灵敏度高，准确可靠，成本低，应用广泛。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及一种多房棘球绦虫循环抗原检测试剂，尤其是涉及一种采用胶体金免疫渗滤技术(immunofiItration)进行的多房棘球绦虫循环抗原免疫渗滤检测试剂盒。
技术介绍
泡状棘球蝴病(Alveolar echinococcosis, AE)是由棘球绦虫属的多房棘球绦虫(Echinococcus multicularia, Em)幼虫寄生所致的人畜共患寄生虫病，在我国主要分布于内蒙、新疆、西藏、甘肃、宁夏、青海和四川西部等广大牧区，是我国目前主要防治的寄生虫病之一。该病被认为是最致命的蠕虫感染病，是世界性最危险的“人畜共患病”之一。人因摄入棘球绦虫虫卵而被感染，继而幼虫在患者肝部呈多泡状、肿瘤样浸润迁移生长，迅速破坏肝实质细胞，最终导致肝机能不全或丧失，并伴有肺、脑等重要器官转移，确诊后10年内患者的死亡率高达90 %以上([l]Filippou D. , Tselepis D. , FilippouG.and Papadopoulos V. Advances in Liver Echinococcosis-Diagnosis and Treatment.Clinical Gastroenterology and Hepatology. 2007，5 (2) :152-159.)。该病的有效治疗目前仍然主要为外科手术，而术后复发率高是AE防治的一大难题。因而，在注重早期诊断和治疗的同时，加强对泡状棘球蚴病患者疗效的监测、病情转归消长的监测以及控制疾病的复发同样具有重要意义。目前主要使用影像学检查，以及酶联免疫吸附实验(ELISA)和蛋白质印迹(Western blotting)等免疫学试验对AE患者进行诊断和病情监测([2]Brunetti E, KernP, Vuitton D A. Expert consensus for the diagnosis and treatment of cystic andalveolar echinococcosis in humans [J]. Acta tropica, 2010,114 (I) :1-16)。影像学检查常使一些非典型和体积较小的病灶与肝癌和肝脓肿等相混淆([3]张宽，王会苹，黄山，等.肝泡状棘球蝴病的CT诊断[J].实用放射学杂志，2011,27(7) :1117-1119)，而免疫学诊断具有快速、敏感、特异和价廉等优点，因此目前被广泛应用于该病的临床诊断和流行病学调查。但由于免疫学诊断所用抗原种类和质量等因素的影响，往往缺乏敏感性和特异性，与细粒棘球绦虫、猪囊尾蝴及其他寄生虫的抗原存在交叉反应，因此寻找高度敏感、特异的检测方法一直是AE诊断及防治的研究热点。目前运用于诊断的重组抗原多以检测多抗为主，然而基于多抗的免疫学检测方法的特异性和敏感性均有待提高([4]Carmena D，BenitoA, Eraso E.The immunodiagnosis of Echinococcus multilocularis infection. Clin.Microbiol. Infect,2007，13 :460-475)。寄生虫循环抗原(circulating antigen, CAg)是指生活虫体排放到宿主体液内的大分子微粒，主要是排泄分泌物或脱落物中具有抗原特性，并且能被血清免疫学试验所检出的物质。由于循环抗体在患者治疗后仍能长期存在，故不能区别现症感染和既往感染，不宜作疗效考核之用。一般认为检测CAg能提示有活动性感染存在，可用于判断现症患者及评价疗效等，因此CAg成为一种诊断靶抗原。随着对寄生虫CAg研究的不断深入，认识到它在寄生虫病发生发展和病理生理中的作用和地位，对CAg的研究内容已扩展到消长、转归等规律性探索，从而对其在免疫病理和免疫调节机制中的作用有所认识。早期的血清学方法使用多房棘球绦虫粗提物作为抗原，与其他病原体(如细粒棘球蝴)存在交叉反应，因此假阳性也时有发生。随着分子生物学技术的普及，将重组抗原应用于多房棘球绦虫实验已经越来越多，目前研究比较多的多房棘球绦虫抗原有EM2、EM4、EM10、EM13、EM16等，采用重组DNA技术制备的重组抗原可以克服多房棘球绦虫粗提物的缺点，能快速、经济地制备无限量特异重组多房棘球绦虫抗原([5]李文桂，陈雅棠.多房棘球绦虫eml8研究进展[J].中国人兽共患病学报ISTIC，2009，25(1) :56-57)。建立一种简便快捷的试剂来筛查，对AE患者CAg的检测不仅可以辅助循环抗原检测对疾病进行诊断，而且对疾病治疗的疗效考核和病情监测具有重要意义。
技术实现思路
本技术的目的是提供一种多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒。本技术设有检测板、金标记抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体和洗涤液，所述检测板设有载体介质、微孔滤膜、吸水介质、多房棘球绦虫循环抗原检测点和对照点；所述多房棘球绦虫循环抗原检测点和对照点依次设在微孔滤膜上；在多房棘球绦虫循环抗原检测点处包被抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体，在对照点处包被多房棘球绦虫抗原EM2和EM18，将点样的微孔滤膜固定于吸水介质上，然后放入载体介质内，所述载体介质的一侧开有与微孔滤膜相对的通孔；所述载体介质包括底板和扣于底板上的盖板，盖板上开设有正对微孔滤膜的通孔，以便于加样。所述载体介质可采用PVC板等。所述微孔滤膜可采用硝酸纤维膜等，所述微孔滤膜的孔径可为O. I O. 5 μ m。所述吸水介质可采用以纤维素为主要成分的纸等。本技术可采用以下方法制备I)制备多房棘球绦虫抗原EM2和EM18，具体方法为采用基因克隆技术，PCR扩增编码多房棘球绦虫抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得多房棘球绦虫重组抗原EM2和 EM18。2)制备多房棘球绦虫重组抗原EM2和EM18的单克隆抗体，具体方法如下(I)制备多房棘球绦虫重组抗原EM2的单克隆抗体，具体方法是将重组抗原EM2与等体积弗氏完全佐剂混合免疫小鼠，免疫小鼠的脾细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞经细胞融合，筛选分泌高滴度抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养、冻存；采用有限稀释法克隆杂交瘤细胞，小鼠腹腔注射阳性杂交瘤细胞；待小鼠腹部明显隆起时，采集腹水，离心取上清，无菌过滤，亲和层析纯化腹水获EM2单克隆抗体。(2)制备多房棘球绦虫重组抗原EM18的单克隆抗体，具体方法是将重组抗原EM18与等体积弗氏完全佐剂混合免疫小鼠，免疫小鼠的脾细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞经细胞融合，筛选分泌高滴度抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养、冻存；采用有限稀释法克隆杂交瘤细胞，小鼠腹腔注射阳性杂交瘤细胞；待小鼠腹部明显隆起时，采集腹水，离心取上清，无菌过滤，亲和层析纯化腹水获EM18单克隆抗体；(3)将抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体和抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体混合；所述抗多房棘球绦虫循环抗原EM2单克隆抗体和抗多房棘球绦虫循环抗原EM18单克隆抗体可按体积比I : (O. 2 5)混合；所述羊抗鼠IgG多克隆抗体的终浓度为I 4mg/mL ;两者点样量为I μ L/mm3 ;所述抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体浓度可为I 4mg/mT,n3)硝酸纤维素膜的点样在多房棘球绦虫循环抗原检测点本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.多房棘球绦虫循环抗原斑点金免疫渗滤试剂盒，其特征在于设有检测板、金标记抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体和洗涤液，所述检测板设有载体介质、微孔滤膜、吸水介质、多房棘球绦虫循环抗原检测点和对照点；所述多房棘球绦虫循环抗原检测点和对照点依次设在微孔滤膜上；在多房棘球绦虫循环抗原检测点处包被抗多房棘球绦虫循环抗原的抗体，在对照点处包被多房棘球绦虫抗原EM2和EM18，将点样的微孔滤膜固定...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘凡，石松林，林丽蓉，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：实用新型
国别省市：