本文公开的发明专利技术涉及用于制备辛伐他汀和相关化合物如胡伐他汀的方法和材料。本公开具体教导LovD酰基转移酶多肽的变体可经工程改造以显示促进其用于生成辛伐他汀和/或胡伐他汀的性质。设计本文所述材料和方法从而能用最少改动将现有产洛伐他汀的发酵设施转化为制备辛伐他汀和相关化合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及用于生物合成化合物如辛伐他汀的方法和材料，包括利用微生物宿主的过程。_6]
技术介绍
辛伐他汀是可分离自土曲霉(Aspergillus terreus)发酵液的天然产物洛伐他汀的半合成衍生物。洛伐他汀和辛伐他汀都是降胆固醇药，能显著降低成人的心脏病风险。洛伐他汀和辛伐他汀由默克公司(Merck Co.)分别作为美降之(Mevacor)和舒降之(Zocor)销售。辛伐他汀是洛伐他汀的更强效衍生物，并在2005年是美国第二畅销药物，单在美国就有45亿美元的预期销售。土曲霉(A. terreus)中用于洛伐他汀生物合成的基因簇(参见例如，J. Kennedy, K.等，Science, 1999，284，1368-1372 ;和 C. R. Hutchinson, J.等，AntonieVan Leeuwenhoek 2000，78，287-295)此前已有描述(参见例如，美国专利号6，391，583，其内容通过引用纳入本文)。在所述基因簇中编码的是46kD的蛋白质LovD，该蛋白最初鉴定为酯酶同系物。洛伐他汀生物合成的直接前体红麴素J(Monacolin J)由上游巨合酶(megasynthase)LovB 组装(参见例如，L. Hendrickson, C. R.等，Chem.Biol. 1999，6，429-439)，(该酶也称为洛伐他汀九酮合成酶，LNKS)，烯酰基还原酶LovC和CYP450氧化酶。五碳单元侧链由LovF (洛伐他汀二酮合成酶，LDKS)通过乙酰-CoA和丙二酰-CoA之间的缩合合成。缩合的二酮由单独LovF结构域进行甲基化和还原性修饰产生共价连接于LovF酰基载体蛋白(ACP)结构域的磷酸泛酰巯基乙胺臂上的a-S-甲基丁酰基硫酯(参见例如，J. Kennedy, K.等，Science, 1999, 284, 1368-1372 和 C. R. Hutchinson, J.等，Antonie Van Leeuwenhoek2000, 78，287-295),随后从红麴素J生成洛伐他汀。在土曲霉中灭活LovD或LovF导致前体红麴素J的积累(参见例如，J. Kennedy, K.等，Science, 1999, 284, 1368-1372 和 C. R. Hutchinson, J.等，Antonie Van Leeuwenhoek2000，78，287-295)。一旦制得洛伐他汀，例如在土曲霉宿主中经发酵制得，可从洛伐他汀生成辛伐他汀。目前，辛伐他汀是洛伐他汀的半合成衍生物。洛伐他汀经土曲霉宿主的发酵获得。纯化该化合物后，如下进行半合成1)2-甲基丁酯侧臂可在碱的存在下水解产生中间体红麴素J;2)将游离酸内酯化；3)将C13处的醇官能团用保护基团(例如，叔丁基二甲基硅烷基)保护；4)将显露的CS醇用酰基底物如2- 二甲基丁酰氯酯化产生C13保护形式的辛伐他汀；以及5)将C13 OH去保护产生辛伐他汀。此前已描述辛伐他汀的各种多步合成(参见例如，PCT WO 2005/066150和美国申请号20050080275与20040068123，其内容通过引用纳入本文)。例如，广泛采用的方法始于洛伐他汀中CS酯的水解产生三醇红麴素J，然后选择性硅烷化C13醇，用二甲基丁酰氯酯化C8醇并使C13醇去保护产生辛伐他汀(参见例如，ff. F. Hoffman,等，J. Med.Chem. 1986，29，849-852)。已研究用脂肪酶和酯酶来酶促转化作为化学衍生的替代(参见例如，PCT WO 2005/040107, PCT WO 94/26920 和 T. G. Schimmel 等，Appl. Environ. Microbiol. 1997,63, 1307-1311，其内容通过引用纳入本文)。但是，区域选择性酯化的要求总是涉及其它醇基团的保护且常引起总体得率降低。因此，能选择性酰化红麴素J的CS的特异性试剂对于辛伐他汀和其它他汀类似物的有效合成很重要。上述方案的变形常见，但是大多数过程总是涉及首先分离洛伐他汀，水解甲基丁酯侧链，保护游离醇，与酰基底物反应，以及去保护。尽管涉及的化学转化相对简单，但它们低效且涉及多个步骤，并因此造成目前制备辛伐他汀的高成本(每颗药3美元)。为此，非常需要能促进高成本效率制备辛伐他汀和相关化合物的方法和材料。
技术实现思路
如下文详述，现可用LovD酰基转移酶多肽的变体在体外或体内产生辛伐他汀和相关化合物，所述变体经工程改造以显示促进其用于生成辛伐他汀和/或胡伐他汀(huvastatin)的性能。本文所述材料和方法设计成使得能用最少改动将现有洛伐他汀制备的发酵设施转化为制备辛伐他汀和相关化合物。本专利技术的实施方式提供设计用于利用制备洛伐他汀的生物方法来制备洛伐他汀的衍生物辛伐他汀的方法和材料。本专利技术还提供设计用于利用制备洛伐他汀的生物方法来制备相关化合物如普伐他汀衍生物胡伐他汀的方法和材料。本专利技术的实施方式包括的材料和方法可用于产生辛伐他汀而无需目前用来产生该化合物的多个化学合成步骤。本专利技术的典型实施方式不需要第一步先纯化洛伐他汀然后进一步半合成过程，而是在发酵过程中联用LovD酰基转移酶多肽的变体和酰基硫酯化合物来产生辛伐他汀和/或胡伐他汀的制备。本文公开的专利技术有多种实施方式。本专利技术的一种说明性实施方式是SEQ ID NO: I所示LovD多肽的变体，所述LovD多肽变体包含至少一种特定氨基酸取代，例如AlOV ；D12G ；K26E ；C40A ；C60N ；A86V ；H161Y ；A190T ；K227R ；G275S ；V334D ;V334F 和 / 或 L361M。本专利技术的一种相关实施方式是SEQ ID NO: I所示LovD多肽的变体，该LovD多肽的变体包含一组氨基酸取代，例如一组至少3个氨基酸的取代在C40和C60位置氨基酸残基处的取代，和在下组氨基酸残基位置处的另外至少一种取代A10 ；D12 ；K26 ；A86 ；A190 ；H161 ；K227 ；G275 ;V334 ;或L361。LovD多肽的此类取代变体中，氨基酸取代可包括在SEQ ID NO: I所示LovD多肽上氨基酸残基位置处未见的19种氨基酸中任一种。通常，所述取代变体与SEQID NO: I所示LovD多肽相比呈现一种或多种改变的性质，例如聚集减少；热稳定性改善；催化活性改善值改善；可溶表达水平改善；和/或25° C下的全细胞活性改善。如上所述，本专利技术的某些实施方式包括氨基酸取代的特定构象。例如，本专利技术的一些实施方式中，LovD多肽变体包含以下各组位置的氨基酸取代氨基酸残基位置C40、C60和A86 ;或氨基酸残基位置C40、C60、A86和A190 ;或氨基酸残基位置C40、C60、D12、A86和G275 ;或氨基酸残基位置C40、C60、D12、A86、C40、C60、A190和G275 ;或氨基酸残基位置C40、C60、D12、K26、A86、C40、C60、H161、A190 和 G275 ;或氨基酸残基位置 C40、C60、D12、A86、A190 和 G275 ;或氨基酸残基位置 C40、C60、A10、D12、K26、A86、A190本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐奕，高雪，谢新开，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：
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