一种鉴定油葵康地6和7号品种纯度的方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定油葵康地6和7号品种纯度方法。通过建立了油葵RAPD技术程序，确定PCR扩增反应各组分的优化组合，以油葵品种康地6和7号及其双亲的DNA为模板，获得能够同时区分父本、母本和杂交种的引物标记OPB05，扩增的康地7号产生的母本特异标记OPB05条带大小为450bp，产生的父本特异标记OPB05条带大小为880bp；杂交种的DNA片段中包含父母本的特征谱带；扩增的康地6号产生的母本特异标记OPB05条带大小为310bp，产生的父本特异标记OPB05条带大小为325bp；杂交种的DNA片段中包含父母本的特征谱带这个引物标记，可有效用于鉴定康地6和7号品种的纯度，具有重要应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体说，本专利技术具体涉及一种鉴定油葵康地品种纯度方法的

技术介绍
向日葵iBelianthus annuus L.)是世界四大油料作物之一，也是我国北方地区的主要油料作物，其作为油料或蛋白质资源日益受到人们的重视。随着向日葵育种技术的不断发展和杂交品种的大面积推广，品种鉴定已成为新品种保护及保护农民利益的重要手段。传统的品种鉴定多用形态学方法，是根据作物的形态特征和农艺生理特征鉴定特定的基因型，它虽是一种最原始的品种纯度检验方法，但简单、直观、易观测记载、长期以来形态标记是鉴定杂交向日葵品种的主要手段。但随着育种新技术的不断发展，品种间的形态学差异越来越小，能用于鉴定的形态性状已显不足，增加了鉴定的困难；而且此法鉴定时间长，费用高。近年来，蛋白质和DNA多态性检测技术迅速发展，尤其是DNA多态性检测技术以其检测材料少、时间短、结果稳定性好、重复性高、 技术简单、成本低而逐渐成为目前检测的主流方法。 DNA分子检测技术基于DNA分子的缺失、插入、易位、倒位、重排或由于存在长短与排列不一的重复序列机制而产生的多态性(polymorphism diversity or fingerprints),从本质上能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段。杂交向日葵品种纯度鉴定应用的分子检测技术有RFLP技术、RAPD技术、SSR技术、AFLP技术。RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)是由 Grodzicker (1974)最早创立的，该技术是利用限制性内切酶酶解不同生物体的DNA分子后，用特异性探针进行 Sothern分子杂交，通过放射自显影来揭示DNA的多态性。由于RFLP标记对DNA的需要量较大(5-10ug)，质量要求较高，技术较为复杂，程序繁多，周期长，费用较高，多态有限，对材料需求量大巨有放射性同位素的潜在污染和危害，因而目前尚不宜于用于品种的纯度鉴定。RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)技术是以基因组 DNA 为模板，以一个随机的寡核普酸序列为引物，一般为9 一 IObp碱基，通过PCR扩增反应，产生不连续的DNA 产物，再经过脂糖凝胶电泳得到多态性的DNA谱带。RAPD技术主要特点是反应灵敏，多态性强，具有简便、快速的优点，既有大量的随机引物可供筛选使用，又不受种属的限制，因而被广泛用于多种作物的品种纯度鉴定。SSR标记在人类及植物的基因组中，均存在着由I 一 4个碱基对组成的简单重复序列(simple sequence repeats,简称SSR),又称之为微卫星(microsatellite), SSR技术已广泛应用于玉米、水稻等作物的品种纯度鉴定，SSR最大的优点在于其扩增产物在进行测序胶电泳分离时具有单碱基的高分辨率，能检测到很高的多态性，遗传信息量较大，并具有较好的稳定性和重演性。AFLP(Amplify Fragment length Polymorphism)技术扩增片断长度多态性是RFLP和RAH)两项技术的结合，是由荷兰科学家 Zabean等人专利技术的一项专利技术。AFLP技术具较好的重复性,但操作复杂,步骤多，对实验技能和仪器精度要求均很高，难以在作物品种纯度鉴定上普及。康地6号新疆康地种业股份有限公司(康地公司)2001年选育的油用向日葵早熟杂交种，株高160-170厘米，叶色深绿，舌状花冠黄色，果盘直径17-19厘米，生育期92天左右。耐高密，抗旱，耐肥水，籽粒容重高，抗向日葵霜霉病，中抗向日葵褐斑病和菌核病。千粒重63克，较康地5号增产20%。杂交油葵康地7号为康地公司2001年选育的油用向日葵早熟杂交种，生长势强，植株整齐，耐病性强，单株产量高，综合性状极优，种康地7号，必将增产增收。亩产可达300公斤左右，耐霜霉病、锈病、菌核病。株形紧凑，花盘倾斜度小，适宜机械收获。综上所述，从传统的形态鉴定、生化指纹检测发展到分子水平和基因水平检测杂交向日葵品种纯度的检验技术经历了从简单到复杂而精确的过程，每一种方法都有其各自的优点和不足，因而至今在农作物种子检验规程中尚无快速的生化或DNA分子检测技术标准程序。现有技术中未见报道有关同时鉴定油葵康地6和7号品种纯度的方法。
技术实现思路
针对现有技术中未见报道有关同时鉴定油 葵康地6和7号品种纯度的方法的技术现状，本专利技术提供，可有效用于鉴定上述油葵杂交种种子的纯度，辨别种子的真伪，利于油葵杂交种种子高效准确的质量控制，加快油葵商品种子的质量检测进程，鉴定体系能够在短时间内对大量样品进行快速鉴定，结果准确可O本专利技术的技术方案通过建立了油葵RAPD技术最佳程序，并确定了 PCR扩增反应各组分的优化组合，以商品油葵品种康地6和7号及其双亲的DNA为模板，进行大量随机引物分子标记的筛选和重复，获得了鉴定出能够同时区分父本、母本和杂交种的随机引物标记0PB05，这个随机引物标记可有效用于鉴定上述油葵杂交种种子的纯度，辨别种子的真伪，利于油葵杂交种种子高效准确的质量控制，加快油葵商品种子的质量检测进程。本专利技术具体提供，具体方法步骤如下。(I)油葵DNA提取取培养2周的油葵幼嫩真叶于研钵中，加入液氮迅速研磨使成均匀粉状，在样品未融化之前加入65°C预热的CTAB提取液500 μ I,充分混匀后把样液移入I. 5 ml离心管中，置65°C水浴50 min,其间颠倒离心管数次；取出样品冷却至室温，分别加入等体积的酚/氯仿和氯仿/异戊醇进行抽提，其中，酚/氯仿按体积比I :1计，氯仿 /异戍醇按24 I计,经4°C 12 000 r/min离心5 min ;取上清液加入O. 6倍体积的异丙醇混勻，于室温放置5-10 min, 12 000 r/min离心5 min,去上清，用100 μ I 70%乙醇洗涤沉淀，置无菌台吹干；用双蒸水溶解DNA沉淀，4°C保存备用；CTAB提取液为50 mmol/L Tris-HCl pH8, O. 7 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA, pH 8，1% CTAB, 20 mmol/L 2-巯基乙醇。(2)PCR扩增反应及程序反应总体积为20ul，其中含IOX反应缓冲液， I. 25mmoI /T, MgCl2, Iu Taq DNA 聚合酶，O. lmmol/L dNTPs, lumol/L Primer, l_5ng 模板DNA ;扩增程序为94°C预变性4min; 94°C变性20sec，37°C退火50sec，72°C延伸 lmin20sec, 40个循环后再于72°C延伸lOmin。(3)胶板的制备待0. 5%琼脂糖胶溶液冷却至50°C左右时，加入最终浓度为0. 5 微克/毫升的EB，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入Ix电泳缓冲液，电泳缓冲液50 X TAE Buffer配制方法称量Tris 242g，Na2EDTA · 2H20 37. 2g溶于IL烧杯中，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面。(4)电泳、观察和拍照取4ml上述步骤(2)PCR扩增反应液加样缓冲液1ml，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定油葵康地6和7号品种纯度的方法，其特征在于，具体鉴定方法步骤如下(1)油葵DNA提取取培养2周的油葵幼嫩真叶于研钵中，加入液氮迅速研磨使成均匀粉状，在样品未融化之前加入65°C预热的CTAB提取液500 μ I,充分混匀后把样液移入1.5ml离心管中，置65°C水浴50 min,其间颠倒离心管数次；取出样品冷却至室温，分别加入等体积的酚/氯仿和氯仿/异戊醇进行抽提，其中，酚/氯仿按体积比I :1计，氯仿/ 异戍醇按24 I计,经4°C 12 000 r/min离心5 min ;取上清液加入O. 6倍体积的异丙醇混勻，于室温放置5-10 min, 12 000 r/min离心5 min,去上清，用100 μ I 70%乙醇洗涤沉淀，置无菌台吹干；用双蒸水溶解DNA沉淀，4°C保存备用；CTAB提取液为50 mmol/L Tris-HCl pH8, O. 7 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA, pH8, 1% CTAB, 20 mmol/L 2-巯基乙醇；(2)PCR扩增反应及程序反应总体积为20ul，其中含IOX反应缓冲液，I. 25mmol/ L MgCl2, Iu Taq DNA 聚合酶，O. lmmol/L dNTPs, lumol/L Primer 引物 0PB05, l_5ng 模板DNA ;扩增程序为94°C预变性4min; 94°C变性20sec，37°C退火50sec，72°C延伸 lmin20sec, 40个循环后再于72°C延伸IOmin ；(3)胶板的制备待0.5%琼脂糖胶溶液冷却至50°C左右时，加入最终浓度为0....

【专利技术属性】
技术研发人员：王沛政，段维，杨勇刚，李新鹏，
申请(专利权)人：新疆康地种业科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：