具有脱卤素酶活性的酶及其使用方法技术

本发明专利技术涉及卤烷脱卤素酶和编码卤烷脱卤素酶的多核苷酸。此外还提供了设计新脱卤素酶的方法及其使用方法。脱卤素酶在pH和温度升高的情况下活性和稳定性增加。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术总的来说涉及酶、编码这些酶的多核苷酸、这种多核苷酸和多肽的应用，更特别地涉及具有卤烷脱卤素酶活性的酶。
技术介绍
环境污染物由大量和多样的化学物质组成，这些物质中的许多是有毒的、危害环境的，在1979年被美国环保机构指定为重点的污染物。微生物和酶的生物降解作用是清除这些污染物的ー种方法。因此，已经计划通过微生物和相关的酶方法来处理商业废物以及生物补救被污染的环境。不幸地，许多化学污染物抵抗微生物降解，或者当以高浓度和某种组合存在时对潜在的微生物降解剂具有毒性。卤烷脱卤素酶属于α/β水解酶折叠家族，其中所有的酶具有相似的拓扑结构、反应机制和催化三联体组残基(Krooshof等人，Biochemistry36 (31) :9571-9580, I997)。酶通过水解作用裂解卤烷和卤羧酸中的碳ー卤素键，从而将它们转化为其相应的醇类。此反应对于涉及卤烷的解毒作用是重要的，如氯こ烷、氯甲烷和1，2_ ニ氯こ烷，环保机构认为它们是重点污染物(Rozeboom, H.，Kingma, J.，Janssen, D.，Di jkstra, B.しrystallization of Haloalkane Denalogenase from Xanthooacter autotrophicus (自养黄色杆菌GJlO中卤烷脱卤素酶的结晶化).J Mol Biol200 (3), 611-612(1988) 0卤烷脱卤素酶是由能够完全地在氯化脂肪族化合物上生长的微生物产生的。活性不需要金属或氧水是唯一的底物。自养黄色杆菌(Xanthobacterautotrophicus) GJlO 是利用 1，2_ ニ 氯こ烷和少数其它卤烷和卤羧酸生长的固氮细菌(Rozeboom等人，J Mol Biol 2003:611-612, 1988; Keuning 等人，J Bacteriol 163(2) :635-639. 1985)。它是研究得最好的脱卤素酶，这是因为它的催化反应机制、活性机制和晶体结构是已知的(Schanstra等人，JBiol Chem271(25):14747-14753， 1996)。生物体产生两种不同的脱卤素酶。ー个脱卤素酶用于卤化烷类，另ー个用于卤化羧酸类。大多数有害卤化化合物是エ业产生的，用作清洁剂、杀虫剂和溶剤。自养黄色杆菌的天然底物是1，2- ニ氯こ烷。此卤烷经常被用在こ烯生产中。酶是高度选择性的催化剂。它们的特点是能够以传统合成化学中空前灵敏的立体、区域和化学选择性催化反应。而且，酶有非常多方面的能力。它们可以被修改以在有机溶剂中起作用，在极端pH和温度下工作，以及催化结构上与其天然的生理学底物无关的化合物的反应。酶对大范围的天然和非天然底物起作用，因此实际上使任何有机的前导化合物能够被修饰。而且，与传统的化学催化剂不同，酶是高度对映选择和区域选择的。酶所具有的高度功能基团特异性使人们能够明了产生新活性化合物的合成序列中的每ー个反应。酶还能够催化许多与其天然生理学功能无关的不同反应。例如，过氧化物酶催化过氧化氢对苯酚的氧化作用。过氧化物酶也可以催化与其天然酶功能无关的羟基化反应。其它的例子是催化多肽分解的蛋白酶类。在有机溶液中，ー些蛋白酶类也可以酰化糖类，此作用与这些酶的天然功能无关。本专利技术开发了酶的独特催化特性。尽管在化学转化作用中使用生物催化剂(即纯化酶或粗酶，非活细胞或活细胞)通常需要确定与特定的起始化合物相互作用的特定生物催化剂，但本专利技术使用了对许多起始化合物中存在的功能基团特异的选择的生物催化剂和反应条件。 每个生物催化剂对ー个或数个相关的功能基团特异，井能够与许多含此功能基团的起始化合物相互作用。生物催化反应从单一的起始化合物产生一群衍生物。这些衍生物可以接受另ー轮生物催化反应以产生第二群衍生物化合物。生物催化的衍生作用的每一次重复可以产生原始化合物的数千变异体。酶在起始化合物的特异位置起作用而不影响分子的其余部分，这ー过程采用传统的化学方法是很难达到的。这种高度的生物催化特异性提供了在文库中鉴定单ー活性化合物的方法。文库的特征在于用来产生它的生物催化反应系列，即所谓的“生物合成历史记录”。筛选文库的生物学活性和追踪生物合成历史确定了产生活性化合物的特异性反应序列。反应序列是重复的，并确定了合成的化合物的结构。这个鉴定模式与其它合成和筛选方法不同，不需要固定化技术，化合物可以游离在溶液中采用实际上任何类型的筛选试验而被合成和检测。重要的是要注意，酶对功能基团反应的高度特异性可以“追踪”特异性酶反应，特异性酶反应形成生物催化产生的文库。采用机械自动操作进行许多程序性步骤，该自动操作能够每天完成数千的生物催化反应和筛选试验，并保证高水平的精确性和再现性。其结果是，衍生化合物文库可以在大约数周内产生，而采用当前的化学方法会需要数年。(对分子修饰的进ー步教导，包括小分子，见PCT/US94/09174，在此整体加入作为參考文献)。这里讨论的公开文献仅为本申请归档日期前的公布。在此绝不解释为这些公布承认本专利技术相对于现有专利技术没有资格居于这些公布之前。专利技术概述本专利技术提供了ー种具有ー个如SEQ ID NO. :3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，43，45，47中所阐述序列的分离核酸，及其变异体，所述变异体与SEQID NO. :3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，43，45 或 47 具有至少50%序列同一性并编码具有脱卤素酶活性的多肽。本专利技术的ー个方面是ー种分离核酸，其具有如SEQ ID NO:3, 5, 7,9, 11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，43，45，47 (此后被称作“A组核酸序列”)中所阐述的序列，基本上与它们一致的序列和与它们互补的序列。本专利技术的另ー个方面是ー种分离核酸，其包括A组核酸序列，基本上与它们一致的序列和与它们互补的序列中所列序列的至少10个连续碱基。也在另ー个方面，本专利技术提供了编码多肽的分离核酸及其变异体，其中多肽具有SEQ ID NO. :4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，44，46，48 中列出的序列及其变异体，其中变异体编码具有脱卤素酶活性的多肽并与上述序列具有至少50%的序列同一'注。本专利技术的另ー个方面是编码多肽或其功能片段的分离核酸，其中多肽或其功能片段具有 SEQ ID NO:4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，44，46，48 中所列的序列(此后被称作“B组氨基酸序列”)，以及基本上与它们一致的序列。 本专利技术的另ー个方面是编码多肽的分离核酸，其中多肽具有B组氨基酸序列中所列序列以及基本上与它们一致的序列的至少10个连续氨基酸。又在另ー个方面，本专利技术提供了纯化的多肽，它具有B组氨基酸序列中所列的序列，以及基本上与它们一致的序列。本专利技术的另ー个方面是与多肽特异性结合的分离或纯化的抗体，其中多肽具有B组氨基酸序列中所列的序列，以及基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
2000.12.01 US 60/250,8971.具有脱卤素酶活性的分离的、合成的或重组的多肽，其包括Ca)与 SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、44、46 或 48 具有至少50%序列同一性的氨基酸序列；或 (b)编码具有脱卤素酶活性的多肽的(a)的片段。2.分离的、合成的或重组的核酸，其包括(a)与SEQ ID ΝΟ:9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、43、45 或 47 具有至少50%序列同一性的核酸序列，其中所述核酸编码至少ー个具有脱卤素酶活性的多肽；或 (b)Ca)的互补序列；或 (c)编码权利要求I所述的多肽的核酸。3.权利要求I所述的多肽，其中所述多肽包括与SEQID N0:10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、44、46或48具有至少50%同一性的氨基酸序列。4.权利要求I所述的多肽，其中所述多肽包括与SEQID N0:10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、44、46或48具有至少50%同一性的氨基酸序列。5.具有脱卤素酶活性的多肽，其包括Ca)在 SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、44、46 或 48 中阐述的氨基酸序列；或(b)由 SEQ ID ΝΟ:9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、43...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·M·肖特，T·理查森，D·罗伯逊，K·格雷，
申请(专利权)人：维莱尼姆公司，
类型：发明
国别省市：